通过快速便捷的考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量时，其准确性和灵敏度会因固有的非线性而受到影响。本文展示了一种简单的线性化方法，可显著提高检测的准确性，使灵敏度提升约10倍，并大幅降低去垢剂的干扰作用。
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摘要
摘要
考马斯亮蓝Bradford法通过测定590 nm处的吸光度来定量微克级蛋白质含量。该方法是最常用的蛋白质定量技术，可用于细胞裂解液、细胞组分或重组蛋白样品中的蛋白质定量，以实现生物化学测量的标准化。然而，该方法存在固有的非线性问题，影响其灵敏度和准确性。研究表明，在标准测定条件下，590 nm与450 nm处吸光度的比值与蛋白质浓度呈严格线性关系。这一简单改进使检测的准确性和灵敏度提高约10倍，最低可定量至50 ng的牛血清白蛋白。此外，新方案显著降低了常用于制备细胞裂解液的去污剂所带来的干扰。基于质量作用定律和比尔定律建立的线性方程能够完美拟合实验数据。
方案
Bradford 蛋白质标准曲线的线性化：
考马斯亮蓝蛋白测定法，通常称为 Bradford 测定法1，因其操作快速简便且具有相对较高的灵敏度而被广泛应用。然而，在较宽的蛋白浓度范围内，该方法存在显著的曲线弯曲现象（图 1）。因此，标准曲线通常仅采用相对较窄的较高蛋白浓度范围（2–10 μg/ml BSA），此时数据更符合线性回归（图 1，绿色）。但由于非线性特性，待测样品的蛋白浓度必须落在标准曲线的有限范围内，以避免产生较大误差，同时该特性也降低了在有限范围内的测定准确性。当无法获得微克级蛋白样品时，这种非线性问题尤为严重，通常需要对待测样品进行多次稀释。
正如 Bradford 原始论文中所述：“非线性现象的来源在于试剂本身，因为染料两种不同颜色形式的光谱存在重叠。”1 事实上，在通常的酸性 pH 条件下进行检测时，考马斯亮蓝染料存在三种酸碱平衡形式2。红色、蓝色和绿色形式的吸收峰分别位于 470、590 和 650 nm（图 2）。其中蓝色形式可与蛋白质结合，形成在 594 nm 处强烈吸收光的复合物3,4（图 2）。Bradford 还指出：“随着越来越多的染料与蛋白质结合，试剂的背景值持续下降”1（图 3）。因此，我们尝试通过测定在 450 nm 处的吸光度变化（该波长下蛋白质-染料复合物不吸收光），来计算随着蛋白质量增加，590 nm 背景信号的降低程度。我们发现，背景信号的下降仅部分解释了非线性现象，但并非全部原因（图 4）。
我们随后推测，游离染料浓度的降低会导致线性响应的另一种偏差，因为蛋白质-染料结合处于平衡状态5，复合物的形成不仅取决于游离蛋白质的浓度，还取决于游离染料的浓度（图5）。考虑到与游离染料浓度变化相关的这两个因素，我们建立了一个数学方程，用于描述蛋白质浓度与590 nm和450 nm处吸光度比值之间的线性关系（图6）。该理论与实验研究的详细描述可参见我们1996年发表在《Analytical Biochemistry》上的文章6。该数学方程经过实验验证，在整个蛋白质浓度范围内均能产生线性校准曲线（图7）。此外，该方程还通过独立测定Y轴截距的正确pH依赖性数值得到了验证6。
使用微孔板吸光度读数仪改进的 Bradford 蛋白质测定详细实验方案：
- 配制0.1 mg/ml的牛血清白蛋白标准品储备液。也可选择其他标准品，但需注意在所有实验中必须使用同一种标准品。
- 将未知样品用去离子水稀释。目标为5-50 μg/ml然而，蛋白质浓度较高或较低均可接受，因为该检测方法的线性范围无明显限制。但测量值必须处于吸光度读数仪的线性范围之内。
- 将 Bradford 试剂（Bio-Rad）用去离子水稀释 2.5 倍。
- 加入0和10-50 μl 将BSA储备液加入三份孔中（形成0-5 μg BSA 标准曲线）。用去离子水补足至 100 μl/well.
- 在不同的孔中加入 100 μl 未知样品需设三个重复。可使用未知样品的多个浓度以提高检测准确性。
- 添加 100 μl 向所有孔中加入稀释后的Bradford试剂。总体积为 200 μl/well.
- 等待显色至少 5 分钟，但不超过 60 分钟。
- 空白 必须 是 200 μl 去离子水（以及 不 零蛋白染料孔
- 在 590 nm 和 450 nm 处测定吸光度。
- 通过计算590 nm和450 nm处的净吸光度值的比值绘制标准曲线。注意应将零蛋白（仅染料）的数值作为数据点纳入（图8）。
- 根据标准曲线的线性方程（图 9）计算未知样品的浓度。
代表性结果：
与在单一590 nm波长下的吸光度不同，590 nm与450 nm吸光度的比值与蛋白质浓度呈线性关系（图10）。
未知样品的蛋白质浓度可直接利用标准曲线的线性方程（图10，方程）计算得出。
然而，通过测量多个未知样品稀释液可以获得更高的准确性。为此，需绘制两张图。第一张为标准品的校准曲线图，横轴为蛋白质含量（单位：μg）（图11，右）；第二张为未知样品的曲线图，横轴为原始未稀释样品的体积（单位：μl）（图11，左）。两个图中均应包含染料空白值（图11）。未知样品的蛋白质浓度通过将未知样品曲线的斜率除以标准品曲线的斜率计算得出（图11，公式）。
图1. 传统的Bradford标准曲线图。线性范围由绿色符号表示。
图 2. 蛋白质-染料复合物与游离染料的光谱。
图 3. 蛋白质-染料平衡。
图4. 正确计算的背景校正可部分降低非线性。
![显示化学平衡方程 K_eq=[DP]/[D][P] 的化学平衡图；蛋白质相互作用研究。](/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg "figure-protocol-5")
图 5. 蛋白质-染料平衡。
图6. Bradford 蛋白质测定法线性化的数学基础。
图7. Bradford标准曲线的线性化。
图8. 吸光度比值的计算。
图9. Bradford 法线性标准曲线图。
图10. Bradford标准曲线图的线性化。
图 11. 未知样品浓度计算。
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讨论
Bradford 蛋白质测定法因其操作简便且具有相对较高的灵敏度而广受欢迎。本方案所获得的整个蛋白质浓度范围内的线性化结果进一步简化了该测定法，因为待测样品无需落在标准曲线的范围内。
重要的是，改进后的方案相较于原始 Bradford 方案还具有以下优势：
- 提高准确性。
- 灵敏度提高了约一个数量级，使得在微孔板检测中可测定低至 50 ng BSA 的蛋白量6。
- 灵敏度的提升使得在含有去垢剂的情况下仍可进行蛋白质定量。在原始 Bradford 方案中，细胞裂解常用的去垢剂通常会干扰检测，导致对蛋白质的响应信号减弱。灵敏度提高一个数量级后，样品可被稀释至去垢剂干扰完全消除的程度。请注意，标准品应含有与待测样品稀释后相同种类和浓度的去垢剂。
蛋白质-染料复合物和游离红色染料的吸收峰分别位于594 nm和470 nm。建议在590-600 nm处测定吸光度，以获得对蛋白质浓度变化的最大灵敏度；在450-485 nm处测定，以确保...
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致谢
本文献给已故的 Zvi Selinger 博士，以纪念他生前主持了本文所述的原始研究工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bradford 试剂 | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 牛血清白蛋白 | Amersco | 0332 | |
| 多功能酶标仪 | BioTek | Synergy2 |
参考文献
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G. Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).
- Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).
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