通过快速便捷的考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量时，其准确性和灵敏度会因固有的非线性而受到影响。本文展示了一种简单的线性化方法，可显著提高检测的准确性，使灵敏度提升约10倍，并大幅降低去垢剂的干扰作用。
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本文内容
摘要
摘要
考马斯亮蓝Bradford法通过测定590 nm处的吸光度来定量微克级蛋白质含量。该方法是最常用的蛋白质定量技术，可用于细胞裂解液、细胞组分或重组蛋白样品中的蛋白质定量，以实现生物化学测量的标准化。然而，该方法存在固有的非线性问题，影响其灵敏度和准确性。研究表明，在标准测定条件下，590 nm与450 nm处吸光度的比值与蛋白质浓度呈严格线性关系。这一简单改进使检测的准确性和灵敏度提高约10倍，最低可定量至50 ng的牛血清白蛋白。此外，新方案显著降低了常用于制备细胞裂解液的去污剂所带来的干扰。基于质量作用定律和比尔定律建立的线性方程能够完美拟合实验数据。
方案
Bradford 蛋白质标准曲线的线性化：
考马斯亮蓝蛋白测定法，通常称为 Bradford 测定法1，因其操作快速简便且具有相对较高的灵敏度而被广泛应用。然而，在较宽的蛋白浓度范围内，该方法存在显著的曲线弯曲现象（图 1）。因此，标准曲线通常仅采用相对较窄的较高蛋白浓度范围（2–10 μg/ml BSA），此时数据更符合线性回归（图 1，绿色）。但由于非线性特性，待测样品的蛋白浓度必须落在标准曲线的有限范围内，以避免产生较大误差，同时该特性也降低了在有限范围内的测定准确性。当无法获得微克级蛋白样品时，这种非线性问题尤为严重，通常需要对待测样品进行多次稀释。
正如 Bradford 原始论文中所述：“非线性现象的来源在于试剂本身，因为染料两种不同颜色形式的光谱存在重叠。”1 事实上，在通常的酸性 pH 条件下进行检测时，考马斯亮蓝染料存在三种酸碱平衡形式2。红色、蓝色和绿色形式的吸收峰分别位于 470、590 和 650 nm（图 2）。其中蓝色形式可与蛋白质结合，形成在 594 nm 处强烈吸收光的复合物3,4（图 2）。Bradford 还指出：“随着越来越多的染料与蛋白质结合，试剂的背景值持续下降”1（图 3）。因此，我们尝试通过测定在 450 nm 处的吸光度变化（该波长下蛋白质-染料复合物不吸收光），来计算....
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讨论
Bradford 蛋白质测定法因其操作简便且具有相对较高的灵敏度而广受欢迎。本方案所获得的整个蛋白质浓度范围内的线性化结果进一步简化了该测定法，因为待测样品无需落在标准曲线的范围内。
重要的是，改进后的方案相较于原始 Bradford 方案还具有以下优势：
- 提高准确性。
- 灵敏度提高了约一个数量级，使得在微孔板检测中可测定低至 50 ng BSA 的蛋白量6。
- 灵敏度的提升使得在含有去垢剂的情况下仍可进行蛋白质定量。在原始 Bradford 方案中，细胞裂解常用的去垢剂通常会干扰检测，导致对蛋白质的响应信号减弱。灵敏度提高一个数量级后，样品可被稀释至去垢剂干扰完全消除的程度。请注意，标准品应含有与待测样品稀释后相同种类和浓度的去垢剂。
蛋白质-染料复合物和游离红色染料的吸收峰分别位于594 nm和470 nm。建议在590-600 nm处测定吸光度，以获得对蛋白质浓度变化的最大灵敏度；在450-485 nm处测定，以确保.......
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致谢
本文献给已故的 Zvi Selinger 博士，以纪念他生前主持了本文所述的原始研究工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bradford 试剂 | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 牛血清白蛋白 | Amersco | 0332 | |
| 多功能酶标仪 | BioTek | Synergy2 |
参考文献
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G.
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重印与许可
