由迎面而来的RNA聚合酶导致停滞的复制叉的直接重启

摘要

当复制体与迎面而来的RNA聚合酶（RNAP）发生碰撞后其命运尚不清楚。我们发现，复制体在与迎面而来的RNAP碰撞后会停滞，但在将RNAP从DNA上移除后可恢复延伸。Mfd通过促进碰撞后RNAP的移除，从而促进复制的重新启动。

摘要

体内研究表明，复制叉会因与对向转录复合物相遇而停滞。然而，对向碰撞发生后复制体和RNA聚合酶（RNAP）的命运仍不清楚。在此，我们发现E. coli复制体在与迎面而来的转录复合物发生碰撞时会停滞，但并不会因此解体，而是复制叉能够保持高度稳定，并最终通过将RNA聚合酶（RNAP）从DNA上移除后恢复延伸。我们还发现，转录-修复偶联因子Mfd可通过促进RNAP的移除，直接推动复制叉在碰撞后重新启动。这些结果揭示了复制装置本身具有内在稳定性，并阐明了转录偶联修复通路在促进复制叉越过RNAP阻滞位点过程中的新功能。

方案

该方法已在 Pomerantz 和 O'Donnell，《科学》327卷，590-592页（2010年） 报道的研究中使用。

1. RNA聚合酶停滞延伸复合物的组装操作步骤如下：

将终浓度为 500 nM 的 E. coli RNAP σ⁷⁰ HE 与终浓度为 5 nM 的含有 T7A1 启动子的生物素标记 3.6 kb DNA 模板在 100 μl 缓冲液 A（20 mM Tris-Cl (pH 7.5)、8 mM MgCl₂、0.5 mM EDTA、5 mM DTT、10% 甘油）中混合，于 37 °C 孵育 10 分钟。随后加入 100 μM ApU 以及各 40 μM 的 GTP、ATP 和 CTP，继续在 37 °C 反应 10 分钟。

2. 将停滞的RNAP延伸复合物固定到链霉亲和素磁珠上的步骤如下：

向上述反应中加入 200 μl 链霉亲和素磁珠（Invitrogen），室温孵育 10 分钟。

3. 固定化的停滞RNAP延伸复合物的纯化步骤如下：

将上述珠子用含有0.75 M NaCl、200 μg/ml 肝素和20 μg/ml 单链DNA的0.9 ml缓冲液A洗涤5次（每次洗涤后通过磁分离去除上清液）。随后，珠子用0.9 ml缓冲液A再洗涤2次。

4. 相对于迎面而来的RNAP，在其下游形成复制叉的操作步骤如下：

将上述珠子重悬于100 μl New England Biolabs buffer 4中，并加入10单位的Sap I（New England Biolabs），在37 °C下孵育10分钟。珠子用0.9 ml缓冲液A洗涤3次，然后重悬于50 μl Quick T4连接反应缓冲液（New England Biolabs）中。加入2 μl Quick T4连接酶（New England Biolabs）以及终浓度为6 nM的预退火叉状DNA（RP10、RP22、RP25），在室温下反应10分钟。珠子再用0.9 ml缓冲液A洗涤3次。

5. 复制叉处复制体的组装及前导链合成的起始按如下步骤进行：

将448 pmol的DnaB（以六聚体形式）与150 μl缓冲液A（20 mM Tris-Cl（pH 7.5）、8 mM MgCl₂、0.5 mM EDTA、5 mM DTT、10%甘油）在23 °C下孵育30秒。随后加入4.9 pmol的Pol III*（不含β亚基的Pol III全酶）、15 pmol的β亚基、2 mM ATP以及每种60 μM的dGTP和dATP，总体积达200 μl，并在37 °C下继续孵育5分钟。通过加入10 μg SSB、每种24 μM的dATP和dTTP，以及[α-³²P]dTTP和[α-³²P]dCTP（比活性为3,000–5,000 cpm/pmol），启动复制反应，终体积为250 μL。反应10分钟后，加入12 μl 500 mM EDTA终止反应。

6. 放射性标记DNA产物的纯化与浓缩操作步骤如下：

反应终止后，将磁珠（来自上述步骤）煮沸，以去除与磁珠结合的DNA。任何仍残留在磁珠上的DNA通过加入10 µl蛋白酶K溶液、在50 °C下孵育30分钟进行去除。随后将磁珠煮沸，并通过磁力分离移除上清液。合并含有DNA的上清液，使用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化。纯化后的放射性标记DNA产物随后在碱性琼脂糖凝胶中进行分析。

*在无对向RNAP停滞延伸复合物的情况下进行复制时，操作步骤同上，但省略σ⁷⁰。

代表性结果：

复制体与迎面而来的RNA聚合酶（RNAP）发生碰撞时，通常会产生两条长度分别为2.5 kb和3.6 kb的产物。其中2.5 kb的产物代表从复制叉到停滞的RNAP之间的DNA长度，这是复制体在与RNAP碰撞后停滞所致。3.6 kb的产物代表全长DNA，其产生原因可能是RNAP对启动子的占据不完全，或复制体部分穿越了迎面而来的RNAP。理想或准确的实验结果应显示约有50%的全长DNA生成。然而，在某些情况下，RNAP对启动子的占据程度较低，导致更高比例的全长DNA被观察到，因为更多的复制体未遇到迎面而来的RNAP。在没有停滞RNAP存在的情况下进行复制，则仅产生全长DNA（3.6 kb）。

图1 复制体被迎面而来的RNAP阻碍。
(A) 实验设置。E. coli RNAP停滞的延伸复合物在含有T7A1启动子的生物素标记DNA上组装，方法如前所述（9）。简言之，通过将RNAP全酶与生物素标记的DNA孵育10分钟，随后加入ApU、GTP、ATP和CTP再孵育10分钟，在启动子下游20个碱基对处形成停滞的延伸复合物。然后加入链霉亲和素珠孵育额外10分钟，再用含有0.75 M NaCl、200 mg/ml肝素和100 nM单链DNA的缓冲液各0.9 ml洗涤珠子五次，以去除不稳定的RNAP-DNA复合物和过量的NTP。随后用SapI酶切DNA，洗涤后连接预先退火的分叉DNA。在组装复制体之前再次洗涤珠子。启动子位于分叉点上游2.5 kb处，其方向可引导转录朝向复制分叉进行。(B) 加入DnaB后组装复制体，并在存在（泳道2）或不存在（泳道1）迎面而来的RNAP的情况下启动复制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dynabeads M-270	Invitrogen	653.05
SapI	新英格兰生物实验室	R0569S
T4 快速连接酶	新英格兰生物实验室	M2200S
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104