结直肠癌进展过程中场效应缺损中Pms2、ERCC1、Ku86、CcOI的表达缺失

摘要

在结肠腺癌两侧各10 cm范围内，整个隐窝中Pms2 和/或ERCC1 表达降低或缺失是一种常见现象，这可能是具有高突变性和癌变进展倾向的场效应缺陷的基础。而Ku86 或 CcOI 的缺陷在这些场效应缺陷中则少见得多。

摘要

在致癌过程中，“场效应缺陷”在临床上被认识，是因为某些癌症幸存者极易在相同组织类型中发生其他恶性肿瘤，且常常出现在邻近部位。结肠癌中已观察到此类场效应缺陷。在结肠腺癌或伴有进展性异型增生的腺瘤周围组织学正常的黏膜中，应能以较高频率检测到导致结肠场效应缺陷的分子异常；而在无结肠新生物患者的结肠黏膜中，这些异常的出现频率则较低。

通过免疫组织化学方法发现，在结肠腺癌或晚期结肠肿瘤周围两侧各10 cm范围内的完整隐窝中，两种DNA修复蛋白Pms2和/或ERCC1的表达常常降低或缺失。Pms2是一种具有双重功能的蛋白质，既参与DNA错配修复，也在DNA损伤过多的细胞发生凋亡过程中发挥作用。ERCC1则参与DNA核苷酸切除修复。ERCC1和Pms2表达的降低或缺失将导致细胞既具有更强的存活能力（即对凋亡抵抗），又具有更高的突变水平。ERCC1和Pms2表达的降低或缺失可能是结肠癌进展的早期步骤之一。

有研究报道，DNA修复基因Ku86（参与DNA非同源末端连接）和细胞色素c氧化酶亚基I（参与细胞凋亡）在结肠癌邻近的黏膜区域表达均有所降低。然而，通过免疫组织化学方法检测其表达水平发现，在结肠癌或进展期结肠肿瘤周围存在场效应缺陷的隐窝中，仅观察到低至中等频率的隐窝表现出这两种蛋白表达缺失。

本文展示了我们对隐窝中ERCC1、Pms2、Ku86和CcOI表达水平的评估方法。结果显示，在结肠肿瘤周围长达20 cm的区域内，Pms2和ERCC1完全缺失的隐窝所占比例通常高达70%至95%，而Ku86缺失隐窝的比例中位数为2%，CcOI缺失隐窝的比例中位数为16%。整个结肠长约150 cm（约5英尺），其黏膜层约含有1千万个隐窝。因此，结肠癌周围Pms2和ERCC1缺陷的隐窝数量可能多达100万个。结肠癌正是起源于有缺陷的隐窝。

方案

制备用于载玻片观察的组织

1. 结肠镜可通过直肠插入结肠。结肠镜是一种长管状器械，其头部装有照明装置和视频摄像头，可通过向结肠内注入空气，将结肠像长气球一样撑开，以更好地观察结肠内部情况。结肠镜还设有通道，可让活检钳伸出至摄像头前端，夹取结肠内壁“皮肤”或黏膜层约3-5毫米范围的组织，以获取活检标本。活检钳还可用于切除结肠内发现的可能具有癌前病变的息肉。
2. 我们在取得患者知情同意后，采集了其正常结肠黏膜组织的活检样本。这些患者正在消化科门诊接受筛查性结肠镜检查。我们的活检样本被放入盛有福尔马林的容器中。4小时后，将福尔马林更换为70%乙醇。
3. 类似组织样本也取自手术切除的结肠标本中距离结肠癌或高级别腺瘤1厘米和10厘米处的区域。这些组织样本同样被置于福尔马林中固定；若组织样本较大，则部分样本在转入70%乙醇前会在福尔马林中保存更长时间。
4. 组织样本被送往组织学实验室进行处理，并包埋于石蜡块中。
5. 将石蜡块置于冰箱中冷却，以便更易于用切片机进行切割。
6. 使用切片机从组织块上切下厚度为4微米的组织切片，并使其漂浮于水面上。
7. 为比较两种蛋白（例如ERCC1和Pms2）的表达情况，可将交替的组织切片分别转移至两张载玻片上，直至每张载玻片上有三个组织切片。例如，可将第1、3、5号切片置于标记为ERCC1的载玻片上，而将第2、4、6号切片置于标记为Pms2的载玻片上。单张载玻片上包含三个经同一蛋白免疫染色的组织切片，有助于判断隐窝染色模式的异常是真实现象还是人为假象，因为假象通常不会在同一切片上的多个组织切片中重复出现。结肠隐窝直径约为60微米，因此一个隐窝可被连续切出约15个切片，使得同一隐窝可在单张载玻片的多个组织切片中被观察到。

组织切片免疫染色

1. 随后将切片进行免疫组织化学标记操作。该过程耗时约8小时，基本属于常规流程。我们所采用的非标准步骤包括使用Sequenza染色容器以及一种名为“Sniper”的降低背景染色的溶液。“Sniper”溶液由美国加利福尼亚州康科德市的Biocare Medical公司以专有配方销售。
2. 此处展示了我们部分操作步骤。
3. 以Pms2免疫组织化学为例，首先将切片置于二甲苯中脱蜡，共更换3次（每次3分钟），随后依次用100%乙醇更换2次（每次2分钟）、95%乙醇更换2次（每次2分钟），最后用蒸馏水更换2次（每次2分钟）。上述操作均在具有负压通风的化学通风橱中进行，以避免实验人员接触有机溶剂蒸气。
4. 当组织最初使用福尔马林固定时，组织样本中的部分蛋白质发生了交联。现在我们需要打断这些交联结构，以便抗体能够识别目标蛋白。将切片置于缓冲液中，并在微波炉中加热至沸腾，随后在中火条件下继续处理10分钟，再于冰上冷却20分钟。此步骤需根据不同微波炉的性能进行测试和优化，直至获得理想结果。需要注意的是，针对CcOI或Ku86的免疫染色，我们使用由9 mL柠檬酸 + 41 mL柠檬酸钠 + 450 mL H₂O配制而成的柠檬酸钠缓冲液（含钠离子），其pH约为6.0；对于ERCC1染色，则使用由2.1 g柠檬酸 + 1 L H₂O + 约5 mL氢氧化钠调节至pH 6.1的柠檬酸缓冲液（添加钠离子最少）；而对于Pms2染色，则使用5 mL VECTOR公司的抗原修复液 + 533 mL H₂O配制的溶液。不同缓冲液的选择旨在增强抗体与特定蛋白表位之间的结合能力。
5. 随后将切片置于3%过氧化氢（以甲醇稀释）中孵育20分钟，接着用蒸馏水冲洗3分钟，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤5分钟。
6. 将切片放入称为Sequenza的扁平窄型染色架中（Thermo Scientific公司的Shandon Sequenza免疫染色系统），并用PBS冲洗。
7. 针对ERCC1或Pms2进行免疫染色的切片，需额外加入3滴来自Biocare公司的专有溶液“Sniper”，处理10分钟，以减少背景蛋白的非特异性染色。
8. 切片用TBST缓冲液冲洗，TBST的配制方法为：1 mL Tween + 100 mL 10x Tris + 900 mL蒸馏水［其中10x Tris的配制为：24.2 g Trizma + 80 g NaCl + 1,000 mL去离子蒸馏水，加入浓盐酸（约15 mL）调节pH至7.6］。
9. 切片用缓冲液冲洗三次后，每张切片加入100微升DAKO生物素化二抗（以TBST缓冲液中的2%牛血清白蛋白按1:100稀释），室温孵育30分钟。
10. 此时配制Vectastain ABC（亲和素-生物素复合物）试剂（Vector Laboratories公司产品），使用2.5 mL PBS、1滴溶液A和1滴溶液B混合，静置30分钟。
11. 切片用TBST缓冲液冲洗三次。
12. 每张切片加入3滴Vectastain ABC试剂，室温孵育30分钟，随后用TBST缓冲液冲洗两次。
13. 将切片浸入DAB（二氨基联苯胺）显色液（2.9 mL DAB + 400 µL PBS + 250 µL过氧化氢）中约5分钟。
14. 切片用去离子水冲洗两次。
15. 使用稀释的苏木精溶液进行复染，时间为10秒。切片随后用自来水充分冲洗，再用去离子水冲洗。
16. 切片依次在95%乙醇中脱水两次（每次2分钟）、100%乙醇中脱水两次（每次2分钟）、二甲苯中脱水两次（每次2分钟）。
17. 向切片滴加数滴Cytoseal XYL（Richard-Allan Scientific公司产品），盖上盖玻片。
18. ERCC1、Ku86和CcOI的免疫组织化学评估采用与Pms2相同的实验流程，仅将Pms2抗体替换为下表中所述的ERCC1、Ku86和CcOI特异性抗体。

评估组织切片中ERCC1、Pms2、Ku86和CcOI表达缺陷的隐窝

1. 首先，我们将使用Motic（DM-BA300）光学显微镜观察组织切片，检测结肠黏膜隐窝中Pms2和ERCC1的表达情况。
2. Pms2和ERCC1均为DNA修复酶，因此它们定位于细胞核内，即隐窝细胞的细胞核中。图1中显示了这一点：代表ERCC1染色的棕色出现在隐窝细胞的细胞核内。我们在显微镜下首先展示的正常隐窝经ERCC1染色后，可见棕色染色显示ERCC1的定位。我们指出隐窝中不同类型的细胞：其中“杯状细胞”形状类似酒杯，细胞核位于隐窝外缘细胞基底部的一个较小区域，而细胞内侧部分则膨大，充满白色的黏液颗粒。另外两种细胞在染色切片中形态相似，分别为吸收细胞（enterocytes）和肠内分泌细胞（enteroendocrine cells），它们的细胞核也位于隐窝外缘的细胞基底部。在从未发生过结肠肿瘤的患者所取的活检组织中，或远离结肠癌病灶的活检区域中，几乎所有隐窝的所有细胞核均表现出如图所示的正常高水平ERCC1表达。
3. 为了明确观察方向，我们首先观察来自无结肠肿瘤患者的活检组织切片，检测其正常结肠黏膜中Pms2、ERCC1、CcOI或Ku86的表达水平。使用40倍物镜，我们可以逐层缓慢扫描整个组织切片，观察其中所有隐窝、间质细胞、任何淋巴滤泡（若存在）以及肌层（若活检组织中包含）。
4. 我们还需指出，在隐窝基底部仅有少数几个细胞为干细胞。这些干细胞可生成整个隐窝约2,000个细胞。若某个干细胞发生突变或表观遗传改变，可能占据整个干细胞微环境，导致整个隐窝对该兴趣酶的染色发生改变（即隐窝转化）。在本张新幻灯片中，我们可见到一些完全缺乏CcOI表达的隐窝，与高表达CcOI的隐窝相邻存在。
5. 随后，我们展示一例结肠癌或高级别腺瘤患者的组织切片。在此切片中，部分隐窝表现出正常的高水平ERCC1表达，而另一些则表达水平较低。使用10倍物镜对组织切片中所有隐窝进行低分辨率拍照，并将图像拼接，从而在单张图像中呈现整个组织切片。随后对各个隐窝进行编号。
6. 酶表达水平高、类似于远离肿瘤区域活检中隐窝特征的染色被定义为“4级”染色。其他等级包括：完全无可见表达者为“0级”，仅勉强可检测到表达者为“1级”，有表达但显著低于4级者为“2级”，表达水平低于4级但仍较强者为“3级”。我们在低分辨率图像上以不同颜色标记每张切片：4级为蓝色，3级为绿色，2级为黄色，1级为橙色，0级为红色。此处我们展示使用40倍物镜逐个观察活检切片的过程，并在低分辨率图像上对隐窝进行标记。

图1. 结肠隐窝显示隐窝细胞核中ERCC1高表达。该图像所有颜色均使用Paint Shop Pro 5对对比度和饱和度进行了同等增强。

代表性结果

1. 不同载玻片上的交替组织切片使我们能够通过免疫组织化学方法观察同一结肠隐窝中两种不同蛋白质的表达情况。同一隐窝分别经Pms2染色和ERCC1染色后的图像，可在相邻显微镜及其对应的相邻计算机显示器上进行比对观察。这使我们能够判断两种蛋白质是否存在联合缺陷，或尽管每种蛋白质的缺陷均较常见，但二者是否独立发生。每张载玻片上包含三个组织切片，因此任何一种蛋白质表达的明显缺陷均可在多个切片上得到验证，排除技术假象的可能性。在结肠癌周围组织中，由于存在导致癌症发生的场效应缺陷，ERCC1和Pms2双缺陷的隐窝出现频率较高。
2. 我们还采用免疫组织化学方法检测了Ku86和CcOI蛋白缺陷隐窝的发生频率。在本张载玻片上，使用40倍物镜对整个Ku86免疫染色的组织切片进行观察，可见该组织切片中Ku86缺陷的隐窝数量较少。
3. 同样，在本张载玻片上，使用40倍物镜对整个CcOI免疫染色的组织切片进行观察，可见仅有中等数量的隐窝表现为CcOI缺陷。

讨论

1. 每张载玻片上必须放置3个组织切片，这一点非常重要。在加入含抗体的介质时可能会产生气泡，导致某些隐窝或隐窝的部分区域因气泡阻隔而无法充分接触抗体，从而染色不充分。隐窝直径约为60微米，组织切片厚度为4微米，因此同一隐窝可能在切片方向上被截取多达15次。通常可以通过隐窝的形态特征作为参考，在同一张载玻片上的多个组织切片中找到相同的隐窝。
2. 在我们最近的研究中，对于较大的组织样本，在Sequenza装置中进行染色可能无法使抗体充分覆盖整个组织。在这种情况下，可优先采用手工染色方法，即手动将含有抗体的液滴逐一滴加至每个组织样本上。
3. 为了在计算机显示器上清晰观察显示免疫染色蛋白表达的棕黄色染色以及显示细胞核DNA的蓝色染色，需对Motic光学显微镜软件进行如下设置：增益（Gain）0，偏移（Offset）0，增强（Enhance）0、255，伽马（Gamma）1.00、0，锐度（Sharpness）1，颜色校正（Color Correction）7，红/绿/蓝（R, G, B）增益1.00，红/绿/蓝（R, G, B）亮度0。分辨率设为1024 × 768，并启用白平衡功能。
4. 本方法可用于评估任何被认为在结肠癌进展过程中起重要作用的蛋白质，分析其在结肠癌或高级别腺瘤周围“场缺陷”区域中表达缺失或可能过表达的发生频率。
   
   
5. 场缺陷是癌症发生过程中的一个组成部分
   “场癌化”（field cancerization）这一术语最早由Slaughter et al. 于1953年提出¹，用于描述上皮组织中某一区域或“场”，该区域因当时尚不明确的机制而被预先改变，从而更易发展为癌症。该术语最初应用于口腔癌的研究。此后，“场癌化”和“场缺陷”被更广泛地用于描述任何更容易产生新发癌症的癌前病变组织，场癌化概念在临床肿瘤学中的重要性也日益受到关注²。我们近期综述了胃肠道癌症中场缺陷的相关证据³，其中包括十余项研究，提供了结肠存在场缺陷的证据。
   
   结肠黏膜中的场缺陷可能源于隐窝干细胞中突变细胞或表观遗传改变细胞的自然选择，使得某一干细胞在生态位更替过程中得以存活⁴。遗传不稳定性或突变表型（可能由DNA核苷酸切除修复或DNA错配修复功能降低引起）会加速这一过程（此前已有报道显示，在结肠癌周围区域中Pms2缺陷较为常见⁵）。如果在结肠黏膜正常的干细胞群体中，某个细胞因基因突变或表观遗传改变而获得选择优势，它将倾向于以克隆方式扩增，并取代邻近的干细胞。在结肠黏膜中，干细胞生态位通常由≤5个细胞占据⁶，这些细胞进而产生整个隐窝约2000个细胞。当突变型或表观遗传改变的细胞类型占据干细胞生态位时，即发生“隐窝转化”（crypt conversion）⁷。
   
   突变克隆（即转化后的隐窝）在结肠上皮中的扩散通常通过隐窝分裂（crypt fission）实现⁸。图2展示了隐窝分裂的一个实例。通过这种方式形成一片异常组织区域。在此区域内，可能发生第二次类似突变，使某个隐窝相对于区域内其他隐窝具有生长优势，从而以克隆方式扩增，形成原发异常区域内的次级异常区域。在此新的区域内，该过程可能在数十年间重复发生多次，直至出现恶性干细胞并克隆扩增形成癌症。如果散发性结肠腺癌普遍通过这一机制发生，那么结肠腺癌通常应伴随并先于异常“场”的存在。因此，在具有高级别上皮内瘤变的腺瘤或结肠癌周围区域，预期可检测到由转化隐窝组成的异常区域中存在可识别的缺陷。
   
   根据这一肿瘤前进展模型，可预期在结肠肿瘤性病变周围、可能进展为癌症的非肿瘤性结肠黏膜组织样本中，能够发现与肿瘤前进展相关的遗传或表观遗传改变。特别是DNA修复酶或凋亡相关蛋白的缺陷，可能通过加剧基因组不稳定性促进肿瘤进展，因此在缺陷“场”中更可能被检测到。
6. 在ERCC1缺陷细胞中，经DNA损伤剂处理后对Pms2缺失具有选择优势
   Nara et al.⁹培养了25株中国仓鼠卵巢细胞43-3B，所有细胞均携带使DNA修复基因ERCC1失活的突变，并用DNA损伤剂MNNG处理这些细胞。在经DNA损伤处理后存活的细胞中，从每种培养物中分离出单个细胞并使其形成克隆。所有分离出的克隆对MNNG诱导的细胞杀伤作用的抗性均比亲本株高出约10倍。在这些克隆中，22株被证实存在DNA错配修复（MMR）缺陷。其中5株通过测序检测，3株显示Pms2表达缺失。这种对Pms2缺陷的选择可能是因为Pms2缺失导致细胞对凋亡的敏感性降低，从而在ERCC1缺失导致DNA损伤累积的情况下仍能存活。（正常情况下，Pms2可感知DNA损伤水平，并在损伤过度时诱导细胞凋亡。）因此，当ERCC1缺陷细胞暴露于DNA损伤时，Pms2缺失的细胞被选择性保留。研究显示，同时缺失ERCC1和Pms2的克隆在紫外线照射后突变率比亲本细胞高出约500至1000倍。
   
   
7. 胆汁酸可引起氧化应激，是DNA损伤剂，并在结肠癌进展中发挥重要作用
   脱氧胆酸是一种胆汁酸，可通过多种机制（包括线粒体损伤）诱导活性氧（ROS）生成，从而增加氧化应激¹⁰。近期研究表明，活性氧可导致表观遗传改变¹¹，且至少有15项研究证实，在高脂饮食导致浓度升高的情况下，胆汁酸可引起DNA损伤¹²。Bernstein et al.¹²的综述指出，膳食脂肪摄入量与结肠癌发病率呈正相关。饮食中的脂肪可刺激胆汁酸分泌至肠道，胆汁酸作为去垢剂协助脂肪消化。因此，高脂饮食与胆汁酸分泌增加相关。在结肠癌高发人群中，粪便胆汁酸浓度升高，长期过量暴露于胆汁酸被认为是结肠癌发生的主要危险因素之一¹³。胆汁酸可能是结肠中场缺陷的诱因之一。

图2. 一个结肠隐窝分裂为3个隐窝。

结论

我们在结肠癌周围的大范围场缺陷中发现，DNA修复基因ERCC1和Pms2（Pms2也参与凋亡过程）缺陷的隐窝频率较高。ERCC1和Pms2的缺陷（由表观遗传改变或突变引起）可能是导致遗传不稳定性的重要早期事件，而遗传不稳定性在结肠癌发生发展中起核心作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PMS2 抗体	BD Biosciences	556415
ERCC1 抗体	Thermo Fisher Scientific, Inc.	MS-671-P1
Ku86 抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9034
CcO1 抗体	Invitrogen	459600
生物素化二抗	Dako	E0413
22% BSA	Informagen, Inc.	2327
Sniper	Biocare Medical	BS966
Vectastain ABC	Vector Laboratories	PK-6100
DAB	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34001
Tween 20	USB Corp., Affymetrix	20605
Cytoseal XYL	VWR international	48212-196
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503