利用动物帽移植（ACT）实验进行组织决定研究 Xenopus laevis

摘要

为了确定组织是否已决定分化命运，将过表达基因产物的动物极帽组织移植到正在发育的Xenopus laevis胚胎的侧 flank 区域。

摘要

许多蛋白质在胚胎发育过程中具有双重作用。那些在特定组织中调控细胞命运决定的蛋白质，也可能影响胚胎更大区域的发育。这使得分析其在特定组织中的作用变得困难。例如，noggin过表达在Xenopus laevis胚胎导致包括眼睛在内的整个前部区域扩张^1,2. 从这一结果尚不清楚Noggin在眼发育决定中是发挥直接作用，还是通过引起神经组织的扩展而间接影响眼睛的形成。这种复杂的表型使得研究其在细胞命运决定中与眼睛相关的特异性功能变得难以分析。我们已开发出一种能够克服该问题的检测方法。利用细胞的多能性特性Xenopus laevis动物帽³，我们开发了一种检测基因产物等分子功能的实验方法noggin或眼区转录因子（EFTFs），通过将该组织移植到胚胎侧面，将外胚层帽转化为特定的组织或细胞类型⁴. 尽管我们发现Noggin蛋白处理或一组转录因子均可在动物极帽中决定视网膜细胞命运，但该方法也可用于鉴定参与其他组织命运决定的基因产物。

方案

第一部分：ACT 实验的设置

1. 按照制造商建议的方法，使用其酚:氯仿纯化法（例如 mMessage mMachine 试剂盒；Applied Biosystems/Ambion，Austin，TX）制备用于注射的加帽 RNA。使用编码荧光蛋白的 RNA 作为示踪剂。我们转录黄色荧光蛋白（YFP）或 mCherry ⁵ 的 cDNA，该 cDNA 位于 pCS2+ 表达载体中。
2. 使用微电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成锥形玻璃尖端。我们使用 Sutter 微电极拉制仪 P-97（Sutter Instruments, Inc.，Novato，CA），操作方法如前所述 ⁶。
3. 使用 10 X Marc's 改良林格液（MMR）储存液（10 mM MgCl₂；20 mM KCl；20 mM CaCl₂；50 mM HEPES；1 M NaCl；调至 pH 7.5，高压灭菌后室温保存）配制表 1 中的无菌溶液。
4. 从雄性青蛙中分离睾丸组织，并将其在含 50 μg/mL 庆大霉素硫酸盐（BioWhittaker，货号 #17-518Z）的无菌 1X MMR 溶液中 4°C 保存。此步骤可在实验开始前一周内完成，但组织活性会随时间下降。
5. 卵产出溶液（1X：150 mM NaCl，2.62 mM KCl，0.8 mM Na₂HPO₄，20 mM Trizma 碱，2.62 mM NaHCO₃ 和 2.75 mM MgSO₄；调至 pH 7.6）可配制成 8X 储存液，于 4°C 保存最多两周。注意：注意该溶液中的污染问题，因为污染会影响卵的质量。
6. 制备注射用培养皿。将 1% 琼脂糖溶于 0.4X MMR 溶液中（微波炉加热溶解），取约 6 mL 熔化的琼脂糖溶液加入 60 mm 培养皿中，轻轻将弹性体模具（图 1）平铺于溶液表面以防止气泡产生，室温冷却约 20 分钟。所需培养皿数量应根据实验条件数（例如 1，YFP；2，YFP+Noggin）以及所需移植宿主胚胎数量确定。在我们的实验中，每种实验条件至少需要 20 个移植宿主胚胎。在 18–19°C 条件下，胚胎处于第 15 阶段的时间约为一小时。若完成 20 次移植需耗时一小时，则假设宿主胚胎能接受全部移植，需设置两个受精时间点。因此共需四个注射培养皿（2 个实验条件 × 2 个受精时间点 = 4）。将培养皿于 4°C 保存，最多可保存一周。
7. 使用 1% 琼脂糖 + 0.7X MMR 溶液并配合模具制备帽状结构分离培养皿，数量与注射培养皿相同，另加每个受精时间点一个额外培养皿（4 + 2 个受精时间点 = 6）。
8. 在显微注射前一天傍晚，向雌蛙注射 500 单位人绒毛膜促性腺激素。将雌蛙在 16–18°C 下过夜保存。

第二部分. Xenopus laevis 胚胎的RNA显微注射

A. 显微注射前准备

1. 移除激素诱导的雌性个体，并将其分别置于含有1X产卵液（ELS）的独立容器中。 注意： 我们不使用在ELS中存放超过两小时的鸡蛋，因为鸡蛋质量会下降。因此，大约在操作前一小时 体外 受精后，我们将弃去养殖箱中所有卵子，仅收集新产的卵。
2. 通过剪断针尖制备显微注射用针头，以获得25-35 μm 直径。将针头放置于皮升注射仪上，并校准至每次注射量为 10 nL。
3. 将培养箱设定为 14°C.
4. 雌性产卵约一小时后，用移液管将卵从水槽中取出，放入60 mm的培养皿中。尽可能去除卵周围的ELS，并替换为1×MMR。卵可立即受精，或在1×MMR中保存最多一小时。进行移植实验时，最好在上午11点、中午12点和下午1点左右分三批进行，每批将两个培养皿中的卵（单层，装至80%满）立即受精。注射后，将卵置于 14°C 以便它们生长至帽状结构分离所需的阶段（8.5–9期）和移植所需阶段（15期；参见第一部分，上述第6项）。
5. 为了检测睾丸的质量，我们通常在清晨进行受精实验（约上午8点），以便在第一个雄性的精子无活性时，能够从另一只雄性中提取睾丸备用。注意：我们将约0.25个睾丸在1 mL 1× MMR中匀浆，每皿卵母细胞加入约5至7滴。
6. 体外 用匀浆后的睾丸组织使卵子受精，一小时后使用去胶液去除卵子的胶质膜164μl 1 M DTT + 10 mL 1 M Tris（pH 8.8），加至50 mL经高压灭菌的超纯水。等待胚胎发育至二细胞期后开始分选，此过程在约2小时后完成 18°C 或在室温下孵育1.5小时（22°C).
7. 使用移液管将色素分布均匀且分裂均等的胚胎（如图3左侧动物帽所示）挑选出来，转移到含有0.4X MMR + 6% Ficoll的注射培养皿孔中。

B. 显微注射

1. 将 Parafilm 覆盖在 60 mm 培养皿盖的顶部。用移液器吸取 2 μl 第一个 RNA 样品点加到 Parafilm 上，并使用 PLI-100 吸取样品以填充注射针。开始注射前，务必确认针头仍能准确释放 10 nL 样品。
2. 在一个培养皿中，向 20-30 个两细胞期胚胎（两个卵裂球）注射 500 pg YFP RNA；在另一个培养皿中，注射目标基因（例如 20 pg Noggin RNA）与 YFP RNA 的混合物。
3. 在另一个注射用培养皿中，每时间点放置 100-200 个未注射的胚胎，并加入 Ficoll 溶液。这些胚胎应与注射后的胚胎同时放入和取出培养箱。这些胚胎将作为第四部分中使用的宿主。
4. 注射后，将所有胚胎在 14°C 下过夜培养。对所有时间点重复上述操作。

第三部分：分离显微注射胚胎的动物极帽

1. 清晨尽早到达，对胚胎进行分期处理，最早的时间点应为9期。移除未存活的胚胎，随后按不同时间点分批进行以下操作。
2. 倒掉每块培养板中的Ficoll溶液，重新加入0.7X MMR/庆大霉素溶液。在帽状结构分离培养皿中加入足量的0.7X MMR/庆大霉素溶液。使用移液器将胚胎从注射用培养板孔中脱离，并转移至新配制的帽状结构分离培养皿中。
3. 在0.7X MMR + 庆大霉素溶液中分离动物帽结构，同时保留2至3个完整胚胎用于分期鉴定。可使用装配有黄色吸头（弯曲至400 μm）的Gastromaster，或使用一对尖头5号镊子进行操作。
4. 将分离的动物帽放回14°C培养箱中，直至次日。宿主胚胎应与动物帽同时从培养箱中取出，以确保其发育阶段与供体组织保持一致。

第四部分. 将囊移植到 flank 部位

1. 从14°C培养箱中取出第一个时间点的帽状组织和胚胎，并对胚胎进行分期。根据所注射的示踪剂类型，筛选出荧光均匀的黄色或红色阳性帽状组织（图2）。
2. 计数帽状组织数量，并取出两倍数量的12–13期胚胎，转移至新配制的含庆大霉素的0.7X MMR溶液注射皿中。使用尖头#5镊子小心去除每个胚胎的卵膜。将去膜后的胚胎转移至含有帽状组织的培养皿中，操作需谨慎。由于失去卵膜保护，胚胎在液面处容易迅速解体。
3. 使用胃部操作器（黄色吸头，200–250 μm弯丝，最高档位）或#5镊子，在14–15期胚胎侧面切除一个边长约200 μm的方形区域（图3）。随后，将一个帽状组织切成两半（使用胃部操作器或#5镊子），并将其中一半组织植入宿主胚胎的切口内。轻轻旋转胚胎使其贴合培养皿孔壁，促进愈合。在胚胎处于15期期间尽可能多地完成此操作。对所有时间点重复该步骤。
4. 胚胎通常在30分钟内完成愈合。使用#5镊子轻轻刮除死亡细胞（白色）。随后将胚胎在18°C下过夜培养。
5. 在解剖荧光显微镜下，筛选出带有荧光标记移植组织的胚胎，并将其重新放回18°C继续培养至42–43期。
6. 用三卡因麻醉动物。此时可在荧光解剖显微镜下拍照记录。完成后，可对样本进行固定、切片及免疫染色，或使用特定组织标记物进行原位杂交（in situ hybridization）分析。

图1. 用于制备胚胎固定培养皿弹性体模具的有机玻璃设计。将一块50 mm × 50 mm、厚25 mm的有机玻璃加工成带圆角的38 mm × 38 mm方形凹槽（深度约5 mm）。在塑料表面钻出直径1.5 mm、深1 mm的圆形且等距排列的孔穴。为制备显微注射培养皿用的弹性体模具，按照生产商说明，将Sylgard弹性体倒入该有机玻璃凹槽中并使其固化。此弹性体模具用于制作注射用板和帽分离板。

图 2. 移植前对动物极帽进行筛选至关重要，因为基因表达可能存在差异。左侧的动物极帽在整个组织中均匀表达 mCherry，而右侧的外植体表达呈斑片状，将被弃用。

图3. 移植动物帽细胞后，宿主蝌蚪在体侧发育出类似眼睛的结构。 荧光图像已叠加在明场图像上。

讨论

在本视频中，我们展示了经典技术的我们的版本所使用的 非洲爪蟾 生物学家，我们对其进行了调整以创建动物帽移植实验。在室温下 非洲爪蟾 胚胎在9至15期发育非常迅速。通过将其置于14°C环境中，可减缓胚胎发育速度，从而在一次实验中完成更多移植操作。若需将胚胎培养至更晚的发育阶段（>42/43）时，我们建议使用转基因venus YFP动物，因为注射的荧光蛋白信号在较年长的蝌蚪中会逐渐减弱。我们利用该检测方法证实了表达EFTFs或Noggin的动物帽组织被特化为形成类眼组织。该检测方法可作为一种简单测试，用于确定目的基因是否对特定细胞命运的决定具有必要性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mMessage mMachine SP6 试剂盒	Applied Biosystems	AM1340
硼硅酸盐毛细玻璃管（1.0 mm 外径 × 0.5 mm 内径）	FHC, Inc.	27-30-1
Sutter 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
硫酸庆大霉素 [50 mg/ml]	Fisher Scientific	BW17-528Z
Sylgard/弹性体试剂盒 1.1 磅	Fisher Scientific	NC9644388
60 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿	USA Scientific, Inc.	8609-0160
人绒毛膜促性腺激素	Intervet Inc.	22219
Pico-Injector 显微注射系统	Harvard Apparatus	650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm 培养箱	Fisher Scientific	11-680-21
移液管	Krackeler Scientific, Inc.	6290-20635A
Dumostar #5 镊子	Fisher Scientific	11295-10