基于磁调制生物传感系统的生物检测快速均相检测方法

摘要

磁调制生物传感系统可用于快速、灵敏且简便地检测生物样本，例如DNA分子和蛋白质。

摘要

一种磁调制生物传感系统（MMB）[1,2] 能够在无需任何洗涤或分离步骤的情况下，快速且均匀地检测低浓度的生物靶标。当存在 IL-8 靶标时，基于“夹心”结构的检测方法会通过 IL-8 靶标以及生物素标记的 IL-8 抗体，将连接有 IL-8 捕获抗体的磁珠与链霉亲和素偶联的荧光蛋白结合。通过在两个电磁极之间施加交变磁场梯度，使磁珠产生振荡运动。与磁珠相连的荧光蛋白被富集到检测区域，其进出正交激光束的运动产生周期性荧光信号，该信号通过同步检测技术进行解调。此前，磁调制生物传感系统已被用于检测伊巴拉基病毒非结构蛋白3（NS3）互补DNA（cDNA）的编码序列[2]。本文所展示的对外部颗粒的操控与富集技术也可应用于其他领域，例如磁耦合药物的递送。体内或增强对比度以体内成像应用。

方案

IL-8 检测：

1. 反应体系总体积为 100 μl，包含以下四种组分，各组分在检测缓冲液中的终浓度如下：10 μl 偶联捕获抗体的磁珠（终浓度为 100 个/μl），2 μl 生物素化 IL-8 抗体（终浓度为 1 纳克/μl），1 μl 链霉亲和素荧光蛋白（终浓度为 20 纳克/μl），以及 1 μl IL-8 目标物（终浓度为 0.48 皮克/μl）。将各组分依次加入检测缓冲液中，随后振荡反应 30 分钟。
2. 对照反应以相同方式制备，但不加入 IL-8 目标物。
3. 反应完成后，无需进行分离或洗涤步骤，直接将反应液转移至比色皿中，使用 MMB 系统进行检测。

MMB 系统：

1. 将比色皿放置在两个电磁极之间的位置。
2. 开启调制电流，等待30秒以使磁珠发生聚集和凝聚。
3. 使用示波器测量锁相放大器的信号。

代表性结果：

对聚集的微珠进行肉眼观察，发现有靶标与无靶标的反应之间存在明显差异。在所有含有靶标的反应中，微珠形成单一且致密的聚集体，以协调一致的方式进出激光束。然而，在所有不含靶标的反应中，微珠的聚集程度较低，其运动也较不协调（见图1）。

图1：夹心式免疫测定法的目视检查（a）无目标物IL-8；（b）含有目标物IL-8。

在检测0.48皮克IL-8靶标时，图1(a)展示了极调制时钟信号（黄色）和光电倍增管（PMT）输出信号（洋红色）。每个极的调制频率为2 Hz。然而，正如理论预期，当微珠通过激光束时，PMT检测到荧光信号，PMT输出电压出现峰值。因此，解调频率为4 Hz。当PMT信号和倍频调制时钟信号（4 Hz）输入至锁相放大器时，灵敏的相位检测器检测到同步信号，并输出高电压（见图2）。

图2： (a) 检测0.48皮克IL-8靶标时的调制时钟信号（黄色）和PMT信号（品红色）。(b) 两次不同扫描下得到的锁相放大器电压结果。

当检测对照样品时，锁相放大器未检测到任何信号。这一事实结合在聚集性上的视觉差异表明，MMB系统能够明确识别IL-8靶标的存 在。

讨论

综上所述，我们证明了MMB系统可用于检测低浓度IL-8靶标（Bio-Plex Precision Pro细胞因子检测方法的检测限为0.5皮克[3,4]）。该系统的应用能力不仅限于IL-8，还可用于检测其他蛋白质。MMB系统的优点在于能够快速检测靶标，且无需任何分离或洗涤步骤。因此，该系统简化了检测流程，便于在野外环境中应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人细胞因子IL-8 Bio-Plex Pro检测试剂盒	Bio-Rad	171-B5008M
重组人IL-8靶标	Thermo Fisher Scientific, Inc.	R202625
生物素标记的单克隆小鼠抗人IL-8抗体G265-8	BD Biosciences	554718
与荧光蛋白偶联的链霉亲和素	Bio-Rad	Streptavidin PE