发育期与成年个体的制备 果蝇 用于活体成像的大脑与视网膜

摘要

本方案描述了三种黑腹果蝇（Drosophila）样品制备方法：1）成年果蝇脑组织解剖，2）成年果蝇视网膜解剖，以及3）发育中眼盘-脑复合体解剖。重点介绍了适用于活体成像的特殊制备技术和条件，尽管所有样品制备方法也可用于固定组织的免疫组织化学染色。

摘要

TheDrosophila大脑和视觉系统被广泛用作研究神经元发育、功能及退变的模型系统。本文展示了三种大脑和视觉系统的制备方法，涵盖了从发育期蛹中正在形成的视盘-脑复合体，到成年果蝇中分离的单个眼睛和大脑的完整范围。所有实验方案均针对组织活体培养进行了优化。此外，在适用的情况下，我们也提供了固定组织免疫组织化学的实验条件。最后，我们展示了利用灌流腔室结合常规及共振式4D共聚焦显微镜对这些样本进行活体成像的实验条件。综上所述，这些实验方案为在不同时间尺度上的活体成像研究奠定了基础，时间范围从以分钟为单位的细胞内功能检测，到以数小时为单位的发育或退行性过程观察。

方案

1. 引言

在本视频中，我们将演示如何制备 果蝇 用于活体成像和免疫组织化学的脑组织与视网膜制备，重点关注感光细胞。首先，我们将展示如何 准备 用于脑部解剖。接下来，我们将演示两种常用于免疫组织化学的基礎解剖方法，这两种方法也是活体样本制备的基础。这两种制备方法分别为成年果蝇脑组织和眼组织的解剖。随后，我们将演示用于 活体 对成年及发育中的大脑进行成像，重点介绍其在光感受器活体成像中的应用。最后，我们将描述活体组织成像的方法，并展示一些利用共振共聚焦显微镜进行活体成像的实例。

2. 解剖准备

1. 为了获得良好的解剖效果，你需要使用锋利的镊子。使用磨刀块或极细的砂纸（>1500目），轻轻地将镊子两端来回研磨，直到尖端形成精细的尖点。我们通常使用标准的磨刀石。本文不详细介绍磨刀技术，但需注意，锋利的镊子对于活体解剖至关重要。每次解剖前我们都会重新磨砺镊子。
2. 对于成年果蝇脑解剖，将果蝇置于CO₂麻醉垫上使其麻醉，并筛选出所需基因型的个体。对于蛹期解剖，只需用镊子小心地从培养管中取出一只蛹，注意避免破坏蛹壳。
3. 用清水润湿一张Kimwipe纸巾。在解剖过程中，你将使用它来清除镊子上的碎屑。将解剖皿放置在体视显微镜的载物台上，并加入HL3溶液¹。所有解剖操作均需在HL3溶液中进行，以确保组织在解剖过程中保持活性和健康状态。此外，我们使用的解剖皿底部覆盖有Sylgard材料，以保护镊子在操作中不受损伤。
4. 如果你计划进行免疫组织化学实验，现在需准备固定液。取180μL HL3溶液加入500μL微量离心管中，再加入20μL 37%甲醛溶液，配制成3.7%的甲醛固定液。
5. 最后，正确的手部姿势对于高质量的解剖至关重要。良好的手部姿势可使镊子保持稳定，并实现精确而细微的操作。首先，将镊子放在拇指侧面，然后将食指垂直向下，指尖轻压在镊子上方。接着，将镊子侧面靠在中指侧面，并移至解剖皿上方。用拇指和中指接触解剖皿表面，同时将手腕稳定地支撑在显微镜载物台上。这样，在解剖过程中便有三个支撑点牢固接触台面，从而能够对镊子进行极其精细的操控。这一技术初学时可能略感别扭，但通过练习，你将很快掌握脑解剖的技巧。

3. 成年大脑

1. 在 CO₂ 麻醉垫上，将一只成年果蝇腹面朝上放置，头部远离操作者手部方向。用镊子夹住头部下方的胸部。操作正确时，果蝇的足和喙会伸展开来。在体视显微镜下观察，用镊子夹住伸展的喙并移除头部。弃去身体部分，将头部浸入溶液中。重新对浸没的头部进行聚焦。整个解剖过程均需在溶液中进行。至关重要的是，必须始终用镊子夹住头部，否则头部会漂浮且难以找回。若在解剖过程中头部移出焦平面，只需将其移回焦平面即可，无需调整显微镜。这一看似简单的操作起初可能较难掌握，但随着练习，保持头部在焦点内会变得越来越容易。
2. 开始解剖时，首先撕开喙与复眼之间的结缔组织。在始终用至少一把镊子牢固夹持的同时，撕开复眼组织。务必确保镊子尖端仅位于视网膜或表皮下方浅层，以避免损伤下方的脑组织。左右交替操作，用镊子逐步撕除视网膜，向头部后方推进。撕除视网膜可提高在整个解剖过程中视网膜外层（lamina）保持附着于视叶的可能性。继续绕至头部后方，沿途撕除表皮。撕开另一侧复眼后，开始剥离表皮。只要确保镊子夹持的是表皮组织，就可避免压碎脑组织！基于此原则，持续剥离表皮和视网膜，直至暴露出脑组织。
3. 一旦脑组织可见，即可开始去除附着在脑上的气管（图 1A）。继续撕除气管和表皮，直至脑组织完全分离。此时，应重新将焦点调整至培养皿底部，以进行后续步骤。需彻底清除残留气管，否则脑组织在过夜抗体孵育过程中可能漂浮。若需对光感受器终末进行成像，建议保留视网膜外层（lamina），但必须去除视网膜，因其含有细胞体及强自发荧光的色素。操作时应小心牵拉毛状且具色素的细胞残余物，避免损伤视网膜外层。此为较精细的操作，需通过练习掌握。
4. 成年果蝇脑组织可在我们将在第6节中讨论的条件下存活数小时甚至数天。进行免疫组织化学实验时，成年果蝇脑现已准备好用甲醛固定²。使用设定为 5μL 的 P20 移液器将成年果蝇脑转移至预先配制的固定液中。继续解剖成年果蝇脑约 20 分钟，通常可获得 4–10 个脑组织。将脑组织在固定液中继续固定 40 分钟（此时间可根据一抗染色效果优化调整）。移除甲醛溶液后，用含 PBS 和 0.4% TritonX-100 的溶液（以下简称 PBS-Triton）在 400μL 体积中清洗脑组织，每次 5 分钟，共清洗 3 次。彻底洗去固定液后，即可加入一抗溶液。

4. 成虫眼睛

1. 按照成年果蝇脑部解剖所述方法开始本解剖操作。将头部浸入溶液并重新对显微镜聚焦后，首先撕开吻部与复眼之间的结缔组织。在吻部上方，将外骨骼与复眼分离。接着，从复眼下方开始，向头部后方逐步分离外骨骼。用一把镊子夹住头后部中央，另一把镊子夹住复眼并向外拉。让复眼自然沉降至培养皿底部（图1B）。此时，视网膜下部的视叶（lamina）通常仍附着在复眼上，可用于对完整光感受器细胞终末进行活体成像。若需继续对光感受器细胞胞体进行活体成像，请转至第4.5节。接下来的三个小节介绍固定复眼的免疫组织化学染色方法。
2. 进行免疫组织化学染色时，使用设定为5μL的P20移液器将复眼转移至固定液中。继续解剖成年复眼，总时长约为10分钟。随后让复眼在固定液中再固定30分钟。移除固定液，并按照成年果蝇脑部解剖所述方法进行洗涤。
3. 若最终希望观察复眼的小眼结构，则必须在此时去除视叶（lamina）。将已固定的复眼放回解剖皿中，清除仍附着的任何气管或脂肪细胞。接着，用一把镊子夹住复眼外侧，另一把镊子小心去除视叶。视叶应能完整剥离，从而暴露出下方的光感受器细胞胞体（图1B）。操作时务必仅夹取视叶组织！否则可能导致光感受器从视网膜脱离。
4. 使用P20移液器将复眼转移至含有400μL PBS-Triton的500μL离心管中。在4°C下轻轻振荡过夜，以去除光感受器中的自发荧光红色色素。次日，可弃去洗涤液，并加入一抗溶液。
5. 对于成年果蝇复眼的活体成像，我们仅使用围蛹期成虫（pharate adult flies），即羽化前的晚期蛹。在此发育阶段，解剖过程中光感受器细胞胞体会与视叶中的终末自然分离。
6. 围蛹期蛹体具有清晰可见的翅膀、复眼及通过蛹壳可辨识的外骨骼。选取一个蛹体，剥除其前端蛹壳以暴露头部区域。小心移除包裹发育中果蝇的薄层内膜。用镊子夹住头部基部并轻轻拉出。在保持头部浸没于溶液中的同时，弃去蛹体其余部分。
7. 后续操作参照上述用于免疫组织化学的复眼解剖方法。然而，在围蛹期成虫阶段，光感受器细胞胞体会更易与视叶分离，从而便于对嵌于视网膜中的细胞胞体进行成像。此外，视叶仍附着于视叶外侧的视叶部分，因此可对远端视叶进行成像。若希望观察近端视叶区域（即可见光感受器终末小体的部位），则应在成年果蝇上进行复眼解剖，因为此时视叶与复眼的连接更为牢固。

5. 培养眼盘-脑复合体

1. 在20%蛹期发育（P+20%）阶段，发育中的眼盘已成为我们实验室活体成像的首选样本，因为这一单层相对较大的发育细胞可通过共聚焦显微镜轻松观察。³
2. 选择P+20%的蛹时，应寻找马氏管——即位于蛹壳下方出现的绿色斑点，并避免选择具有“深色躯体”的蛹。⁴ 选定P+20%蛹后，将其浸入解剖皿中的HL3溶液中，小心移除蛹壳前部的一部分，注意不要刺穿内侧的薄层膜结构。用镊子夹住内膜并轻轻撕开。
3. 仔细检查释放出的内容物，寻找其中非常明显的发育中脑和眼盘组织（图1C）。在此变态阶段，脑与眼盘复合体易于分离。将脑组织移至解剖皿底部，小心地将中央脑与视叶分开。分离所得的视叶/眼盘将用于活体成像。

6. 活细胞成像：在显微镜下

1. 如果仅需在一种或两种溶液中进行短时间成像，可将组织置于载玻片上进行观察。此时，首先按照制造商说明，用Sylgard对载玻片表面进行包被处理。在载玻片中央加入20μL HL3溶液。将解剖后的组织连同额外20μL HL3溶液一同转移至载玻片上。组织必须始终避免暴露于空气中。此外，应避免移液操作或溶液表面张力对组织造成任何机械应力或形变。
2. 进行活体成像时，必须在尽量减少操作和接触的前提下牢固固定组织。我们采用一种可通过微电极施加的水聚合外科胶GluShield来稳定固定脑组织，该技术常规用于电生理实验中的胚胎样本制备⁵。获取用于电生理记录的玻璃电极，折断其尖端，并利用负压（通过口吸产生）将GluShield胶吸入电极末端。折断电极的长度应仅足以使胶体进入即可。随后施加正压，在HL3液滴下的Sylgard表面点加少量胶液。迅速将组织置于胶滴上，并保持活体成像所需的理想方向。此时可使用水浸物镜进行成像。若需加入膜通透性染料，可在成像过程中将其加入灌流液中。
3. 我们使用共振扫描共聚焦显微镜，可在降低光漂白的同时实现快速成像⁶。对于长时间成像，或需要完全更换溶液或多次更换溶液的情况，我们采用灌流室（Harvard IC30共聚焦成像室），并通过蠕动泵将培养液缓慢灌流至活体组织上（图2A）。持续的液体交换和尽量减少GluShield接触，可减轻长时间观察过程中组织出现的压扁现象⁷。需要注意的是，在发育时间过程的成像中，眼盘-脑复合体必须保持完整，且应尽量减少与胶的接触。
4. 使用经Sylgard液滴包被并修整至薄而平整的盖玻片。在盖玻片中央加入20μL HL3溶液，并将活体组织粘附于Sylgard表面。制备密封垫圈，确保气泡可通过灌流室而不使活体组织暴露于空气中（图2B）。垫圈厚度应足以避免压碎组织，同时又足够薄以使组织接近共聚焦显微镜物镜；我们在实验中使用250μm厚度的垫圈。组装灌流室时，需始终确保组织完全浸没于液体中。初始灌流速度可设置为约每分钟100μL，使用蠕动泵进行控制。该速度较快，具体需根据定义灌流室高度的垫圈厚度进行调整。若进行数小时尺度的成像，可能需要在培养液中添加20-羟基蜕皮酮和抗生素，但不应加入抗真菌剂，并将灌流速度降至每分钟约10μL。最后，我们将氧气通入供给灌流室的培养基中。

7. 代表性结果：

在本视频方案的最后，我们展示了利用第5节所述制备方法对发育中的感光细胞进行活体成像的示例。该制备方法利用果蝇（Drosophila）转基因技术，实现细胞特异性表达荧光报告蛋白。在所示示例中，两个荧光报告蛋白在感光细胞特异性驱动子GMR-Gal4⁸的调控下表达：膜标记蛋白myrRFP和早期内体标记蛋白2xFYVE-GFP⁹。每1分钟采集一次三维双通道数据集，成像区域为70×70×17.5 μm，体素尺寸为137×137×700 nm（512×512×26）。视频展示了该四维数据集中某一选定层面随时间变化的动态过程，揭示了细胞内早期内体运输及囊泡融合事件的动态行为。固定组织样本（眼和视叶）的代表性图像见图3。

讨论

用于成像的荧光探针

本文描述了利用三类荧光探针研究黑腹果蝇（Drosophila）视觉系统的优点与局限性：（1）外源添加至活体组织样本的探针；（2）可遗传编码的荧光蛋白，适用于活体和固定样本的成像；（3）用于免疫组织化学的荧光染料，添加于固定后的组织样本中。

1. 外源性探针：

Lysotracker Green DND-26 或 Red DND-99（Invitrogen, Inc.）是市售的荧光膜通透性化合物，可在细胞内强酸性区室中富集，最显著的是溶酶体、晚期内体和自噬体。在纳摩尔浓度下（我们通常使用 50 nM），Lysotracker 可在不到一分钟内完全穿透 L3 和 P+20% 眼盘。由于 Lysotracker 会持续积累并产生碱化效应，我们通常在 5 分钟内完成成像。与眼盘不同，Lysotracker 无法在不破坏组织的情况下穿透脑组织。然而，小心撕裂外层膜可使染料在视叶中渗透数个细胞直径的深度。

Lysosensor DND-189（Invitrogen, Inc.）与Lysotracker不同，Lysosensor不会在酸性区室中积累，但在酸性pH条件下荧光增强。Lysosensor的穿透特性与Lysotracker非常相似。我们使用1μM浓度的Lysosensor。

2. 基因编码探针：

在许多活体成像实验中，我们利用二元 Gal4/UAS 表达系统¹²，表达带有各种荧光分子（如 GFP、TagRFP¹⁰ 或对 pH 敏感的 pHluorin¹¹）标记的基因。在发育中的感光细胞中表达的 Gal4 品系包括 GMR-Gal4（所有感光细胞）⁸ 和 mDelta0.5-Gal4（发育中的 R4 和 R7）¹³。目前已存在多个亚型特异性的 Gal4 驱动品系，它们使用不同的视紫红质（Rhodopsin）启动子¹⁴。在活体成像中特别有用的荧光探针是光转化蛋白。我们已成功使用 Dendra2，一种由绿色转为红色的单体光转化蛋白¹⁵。需要注意的是，Dendra2 的设计是利用 488 nm 氩离子激光进行光转化。然而，在我们现有的实验装置下，无论是在常规还是共振式共聚焦扫描模式中，均无法通过可见蓝光实现有效的光转化。相比之下，使用 405 nm 紫外激光进行光转化则效率较高。

3. 免疫组织化学：

对于固定的成年果蝇眼睛，我们通常选择罗丹明标记的鬼笔环肽（rhodamine phalloidin，Invitrogen, Inc.）或抗Chaoptin抗体（一种光感受器特异性抗体¹⁶）来观察微绒毛结构（图1A）。分析视网膜小叶 cartridges 结构的一个有效方法是联合使用抗Chaoptin抗体¹⁶、胶质细胞标志物抗ebony抗体¹⁷以及抗sec6抗体¹⁸（图1B）。如图3所示，这种抗体组合能够区分视网膜小叶中的主要突触前成分（chaoptin）、突触后成分（sec6）以及上皮胶质细胞（ebony）¹⁹。

组装灌流室

对于活体成像，我们采用一种灌流室，可在不干扰组织制备的情况下实现溶液的缓慢更换。视频中包含了灌流室组装的演示，示意图见图2。灌流室的组装过程如图2A所示。首先将垫圈覆盖在标本上，然后按照图示继续组装。垫圈的作用是在灌流室底座与盖子之间形成一个空间，该空间用于密封组织并使溶液流过。垫圈内部的空间必须包含进液口（溶液从此处进入）、组织制备区域以及出液口（溶液从此处流出）。垫圈有两个关键特征：第一，垫圈必须足够厚以容纳脑组织，但又足够薄以便使用高分辨率物镜进行成像。理想的垫圈厚度取决于具体实验装置的参数。第二，垫圈上的一个切口形成一个隔间，允许气泡通过而不接触标本（图2B）。

显微镜成像

我们使用63倍（数值孔径1.3）的甘油浸没物镜用于灌流腔室，或直接在载玻片的培养基中使用63倍水浸物镜。甘油物镜比油镜具有更大的工作距离。我们采用共振扫描共聚焦显微镜，其扫描速度远高于传统扫描器（分别为8000 Hz与1400 Hz）。共振扫描可在更快速的帧率下实现随时间变化的三维记录。此外，更快的扫描速度显著降低了激光光毒性⁶，这对于活体组织的重复扫描是一个重要优势。必须在激光强度与光电倍增管（PMT）电压（增益）之间取得平衡，以在最小化噪声和光漂白的同时最大化信号。另一个重要考虑因素是，激光对特定区域的作用程度取决于分辨率和缩放倍数。例如，在256×256分辨率、2倍缩放与512×512分辨率、1倍缩放下，目标区域的扫描密度相同，但最大可能的活体成像速度在256×256、2倍缩放下快4倍。为了记录快速移动的细胞内区室的活动，我们已成功使用以下参数进行成像：每个z层堆栈采集5帧，每10秒获取一个z层堆栈，扫描速度为8000 Hz，并采用2次线平均。对于持续数小时的长时间成像实验，我们通常将帧率降低至每几分钟一帧，并选择更大的成像区域，因为样品在此类长时间实验中更可能发生位移。

Drosophila 视觉系统解剖结构

图3展示了成年果蝇（Drosophila）的眼部解剖结构（图3A）、成年脑组织（图3B）以及20%–25%蛹期眼盘/脑复合体（图3C）。图3A显示了附带和不附带视神经叶（lamina）及脂肪细胞的成年眼结构。在成年眼组织解剖过程中，位于眼睛中央、嵌在感光细胞体所形成的凹槽中的视神经叶（左侧），必须在不破坏下方细胞体的前提下被去除（右侧）。对于成年脑组织的解剖，应能够分辨出感光细胞体、视神经叶、视叶、中枢脑以及气管（图3B）。在此解剖过程中，需去除感光细胞和气管，同时保留视神经叶与视叶相连。为了便于识别20%–25%蛹期的眼盘/脑复合体，图3C提供了一张活体图像。

图1. （A）成体脑。（B）成体眼。（C）20%-25% 蛹期眼盘/脑复合体。

图 2. （A）灌流室组装示意图，以及（B）垫圈相对于样本的位置。

图3. （A）使用抗chaoptin对成体小眼面染色。（B）使用抗chaoptin（绿色，感光细胞）、抗ebony（红色，胶质细胞）和sec6（蓝色，中间神经元）对成体视叶染色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184	道康宁	103251252
GluShield	GluStitch, Inc.	GB055QO
20-羟基蜕皮酮	Sigma-Aldrich	H5142-10mg	5 mg/ml，溶于乙醇
特殊设备： 解剖显微镜：Leica Mz12.5 配数字相机 Leica TCS SP5 共聚焦串联扫描显微镜，用于常规与共振扫描活体成像 成像显微镜，包括蓝色（488 nm）、绿色（561 nm）、橙色（594 nm）和远红光（633 nm）激光器，以及特殊的63倍、1.4数值孔径甘油浸没镜头和63倍、1.3数值孔径水浸没镜头。 哈佛仪器共聚焦成像室 RC-30 及蠕动泵型号 720 Sutter 玻璃微电极拉制仪 P-97 软件：Amira 5.2，Visage Imaging