作为模式遗传生物的青鳉胚胎显微注射

摘要

青鳉和斑马鱼在脊椎动物基因组功能的遗传解析方面具有互补性。本方案重点介绍了对青鳉胚胎进行显微注射的关键步骤，这是实验室中利用青鳉和斑马鱼开展胚胎学与遗传学分析的重要技术。

摘要

在本视频中，我们演示了对青鳉单细胞期胚胎进行显微注射的技术。青鳉是一种小型卵生淡水鱼类，可同时用于遗传学和胚胎学分析，与斑马鱼和小鼠类似，也是开展全基因组表型驱动突变体筛选的脊椎动物模式生物之一¹。青鳉与斑马鱼之间相关基因功能重叠的差异使得能够鉴定出在单一物种中无法识别的新表型²，因此青鳉与斑马鱼在解析脊椎动物基因组功能方面具有互补性。

为了利用青鳉鱼胚胎透明且体外发育的特性，显微注射是一项关键技术，可用于注射细胞示踪剂以标记细胞，注射mRNA或反义寡核苷酸以过表达或敲低目的基因，以及注射DNA以建立转基因品系。

方案

1. 交配与收集卵子

1. 雌性和雄性青鳉可通过臀鳍和背鳍的大小与形状轻松区分。雄鱼的臀鳍比雌鱼更大，呈平行四边形，而雌鱼的臀鳍较小，呈三角形。雄鱼背鳍的最后两根鳍条之间有一个明显可见的深凹刻。
2. 青鳉每天可产卵多达40枚，雌鱼在产卵前数小时会通过附着丝将卵成簇携带于腹部下方，随后在水族箱中的植物上将卵剥离。
3. 可用网捕获雌鱼，并用一只手从两侧轻轻握住。然后用另一只手的食指轻轻从腹部将卵挤出。操作完成后可将雌鱼放回水族箱。卵应使用钝头镊子或手指转移至盛有胚胎培养液的6 cm培养皿中。
4. 青鳉配对后在小型交配盒中很少发生争斗，因此可将一对鱼饲养于同一小型带水流的水族箱中，以便每日喂食并持续收集同对亲鱼的卵，时间可达数月。
5. 雌鱼不应单独饲养而无雄鱼共处，因为青鳉雌鱼每日都会排卵；若无法及时产出卵子，雌鱼将无法排卵并导致健康状况恶化。

2. 胚胎清洗

1. 用玻璃移液管将未聚集的卵转移到置于9 cm培养皿盖内的砂纸（P2000粒度，防水）上。去除多余的培养基，但需保留足够的液体体积，以防止胚胎干燥。
2. 用食指轻轻在砂纸上滚动胚胎，施加最小压力，并保持手指与砂纸表面平行，持续约45–60秒，以去除卵膜外层的部分绒毛。每次滚动的胚胎数量不得超过5–7个，此预防措施可最大限度降低胚胎相互挤压而破裂的风险。
3. 将清洁后的胚胎转移至盛有新鲜胚胎培养基的新培养皿中。

3. 制备用于显微注射过程中固定胚胎的琼脂糖平板

注射过程中，将胚胎置于由聚甲基丙烯酸甲酯模具在1.5%琼脂糖中制备的槽内（图1）。琼脂糖的浓度对于妥善固定胚胎至关重要。

1. 首先，制备琼脂糖框架以固定有机玻璃模具。在直径9 cm的培养皿中倒入1.5%的琼脂糖水溶液，厚度为0.5 cm，待其完全凝固后，切出略大于模具尺寸的琼脂糖区域。
2. 倒入1.5%琼脂糖溶液以填充所切出的区域，并将模具放入其中，确保无气泡残留，待琼脂糖完全凝固。该琼脂糖平板可置于冰箱中以加速凝固。
3. 移除模具以形成用于容纳卵的凹槽。加入足够的胚胎培养基以浸没模具，盖好后于4°C保存备用。
   
   
   图1. 自制模具的示意图，用于在琼脂糖平板上制备显微注射用的凹槽。

4. 青鳉胚胎的显微注射

在青鳉中，DNA、RNA、吗啉代寡核苷酸以及示踪染料是通过卵膜显微注射到1至64细胞期胚胎的细胞质中，而不是像斑马鱼那样注射到卵黄中。由于青鳉的细胞质较小且不易观察，建议通过注射罗丹明-葡聚糖等染料进行练习，以掌握该项技术。同时建议添加酚红作为示踪剂，以便确认注射是否成功。

由于覆盖在青鳉胚胎外的绒毛膜较为坚韧，因此需要使用短而坚固且口径较宽的注射针（图2）。请使用含丝玻璃毛细管制备这种坚固且宽口径的注射针。

1. 使用酚红作为示踪剂配制注射液，并用Eppendorf微载针器从针后部将溶液装入注射针中。将注射针连接至空气泵注射仪。
2. 受精后应尽快收集卵子并分散，以便在单细胞阶段进行注射。可通过将胚胎短暂置于冰上（不超过30分钟）以停止细胞分裂，从而增加可注射的胚胎数量。
   
   
   图2. 青鳉与斑马鱼注射针的比较。注意微流控（MF）针尖（上方）更短且更宽，因此在穿刺青鳉胚胎坚韧的卵膜时更为牢固。
3. 用镊子将卵子转移至琼脂糖板中，并将其排列于凹槽内。注射前，应将五个卵子旋转至单细胞胞质的细胞膜可被注射针垂直穿刺的位置。单细胞胞质可通过寻找缺乏小油滴的区域来确定，该区域通常位于卵子油滴最密集一侧的对侧。通过侧向观察可进一步确认该区域为胞质。
4. 将注射针靠近卵子。通过轻轻触碰针尖至卵膜，或使用微型镊子轻触以打开针尖（图3），应可见少量注射液流出。
5. 穿刺卵膜，使针尖进入卵膜内部。调整注射仪的持针压力至相对较高水平，以确保在穿刺坚韧卵膜时因高压而不会发生回流（持针压力设定为80–100 hPa，注射压力设定为500–700 hPa）。
6. 迅速刺破胞膜，将针尖插入胞质中。
   
   避免将针尖插入卵黄。与斑马鱼不同，注入卵黄的物质不会转移至胞质。当液体注入卵黄时，可见清晰的边界；而注入胞质时，边界则呈弥散状（图4）。
   
   有时针尖可能被琼脂糖或碎屑堵塞，可用镊子轻触或重新折断针尖以清除堵塞。若注射过程中针尖断裂，可在胚胎培养液中观察到气泡，且注射物质会流失。注射应沿琼脂糖通道自上而下、模具内自左至右系统性进行。
7. 注射后的胚胎应转移至含有胚胎培养液的洁净培养皿中，并在适宜温度下培养发育。
   
   
   图3. 注射前打开针尖的操作步骤。1：将针尖移近胚胎的卵膜；2：轻触卵膜并前后轻微移动以折断针尖；3：当有少量注射液从针尖流出时，表明针尖已成功打开。

5. 代表性结果

图4. 注射后青鳉胚胎的代表性图像。图A显示将罗丹明-葡聚糖正确注射至单细胞期青鳉胚胎细胞质中的代表性图像。图B显示将罗丹明-葡聚糖错误注射至单细胞期青鳉胚胎卵黄囊中的代表性图像。图C和图D分别显示图A和图B中胚胎在注射后约30小时的发育情况。EM：胚胎；图C和图D中胚胎头端朝上，为背侧视角。请注意，图D中胚胎本体不呈红色，因为染料被错误地注入了卵黄囊。图B和图D中的箭头指示错误注入卵黄囊的罗丹明-葡聚糖，可见明显的环形边界。图A和图B中的虚线表示单细胞期胚胎细胞质的轮廓，为侧向视角。

讨论

在本视频中，我们演示了一种将细胞示踪剂、mRNA、DNA 或反义寡核苷酸注射到单细胞期青鳉胚胎中的方法。该技术使我们能够研究多种发育过程 体内 实时进行。该过程及其所提供的后续详细分析有望显著增进我们对脊椎动物器官发生及其潜在细胞生物学机制的理解。此类知识可能对再生医学具有重要意义，并带来治疗应用前景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4" 细网	工具	J K Aquatics Ltd.	MD001	用于采卵过程中捕获鱼类。
胚胎培养液	试剂	自制		200 ml 50X 储存液，1 ml 1% 亚甲蓝溶于 H2O / 10 升反渗透水（50X 储存液配方：NaCl 14.7 g，KCl 0.6 g，CaCl2·2H2O 2.4 g，MgSO4·7H2O 4.0 g / 1 升反渗透水）。
细粒度防水砂纸 - P2000 粒径	工具	Hermes Abrasives Ltd.		用于滚动或清洁带卵膜的胚胎，粒度极细。
硼硅酸盐玻璃毛细管	工具	Harvard Apparatus	GC100-10F	用于制作显微注射针。
微量移液器拉制仪	设备	Narishige International	Model PP-830	用于制作显微注射针。
Eppendorf 微量加样器	工具	Eppendorf	5242956.003	用于向显微注射针中加样。
显微注射装置	设备	Eppendorf		型号 5242。
显微操作器	设备	Narishige International		型号 MN151。
琼脂糖注射板	工具	自制		用于在注射过程中固定胚胎。