脑室下区的表面观：整体染色与室管膜液流

摘要

侧脑室壁包含成年哺乳动物大脑中最大的生发区域。传统上，对该区域神经发生的研究依赖于经典的组织学切片技术。本文我们介绍一种替代方法——全脑组织铺片技术，该方法可对这一生发区域提供全面的、表面观的视野。

摘要

侧脑室壁含有成年哺乳动物大脑中最大的生发区域。这些脑室壁中的室下区（SVZ）是研究神经干细胞行为及成年神经发生调控机制的广泛采用的模型系统。传统上，此类研究依赖经典的组织学切片技术。本文介绍一种替代方法——全组织染色技术，可提供该生发区域完整且正对的视野。与切片相比，全组织标本能更好地保留SVZ内的完整细胞结构及细胞间的空间关系。该方法最近揭示，成年神经干细胞（即B1型细胞）与分化成熟的室管膜细胞共同构成混合性神经上皮，排列于侧脑室表面。此外，该技术已被用于研究室管膜细胞的平面极性及其在脑室内驱动的脑脊液流动。随着越来越多证据表明成年神经干细胞是一个具有区域特异性的异质性细胞群体，全组织染色技术有望成为解析这一干细胞微环境组织结构与区域划分的关键工具。 关键词：室下区，神经干细胞，成年神经发生，全组织染色，室管膜细胞，B1型细胞，侧脑室，干细胞微环境

方案

I. 用于脑室管膜流动检测的荧光微珠填充玻璃微电极的制备（若仅制备用于染色的全脑组织样本，可跳过这些步骤）。

1. 将 Wiretrol 5 µl 玻璃毛细管固定在玻璃微电极拉制仪上，调节加热器和电磁阀设置，以拉制出具有平滑、浅锥度的微电极。
2. 将正压气源连接至拉制好的微电极末端，以 45° 角轻轻将电极尖端压在金属格栅表面，以形成斜面尖端。正压气流有助于清除微电极内部的玻璃碎屑。用蘸有乙醇的纸巾清洁斜面尖端的末端。
3. 在带有微米尺的显微镜下检查电极尖端。尖端应具有平滑的斜面，内径约为 100 µm。可使用更小的直径，但常会导致荧光微珠堵塞微电极。
4. 用矿物油从后端填充微电极至一半体积，然后将蘸有润滑脂的推杆插入微电极后端。通过手动推动推杆，使矿物油的弯月面前进至微电极尖端。
5. 将微电极和推杆固定在显微操作仪上，然后将显微操作仪的电极夹持器旋紧至带有可调高度的小型固定臂上。
6. 从前端装入荧光微珠溶液，该溶液由 50% 荧光微珠储存液、45% 水和 5% 甘油组成。添加甘油以增加溶液密度，使其滴加到整体样本上时微珠能够沉降到表面。
7. 将显微操作仪放置在安全位置，防止针头意外折断，随后进行整体样本解剖。

II. 整体解剖与固定

1. 为准备整体解剖，将足量的 L-15 Leibovitz 培养基加热至 37°C。每只待解剖动物大约需要 10 ml 培养基。同时在体视显微镜旁准备好解剖和固定所需的所有耗材：剪刀、带齿大镊子、光滑细镊子、Sharpoint 22.5° 显微外科穿刺刀、解剖皿、纸巾、生物危害袋，以及一个置于冰上的 24 孔板，内含 4% 多聚甲醛（可含或不含 0.1% Triton X-100）。Triton X-100 可降低 PFA 溶液的表面张力，从而减少将整体样本浸入该溶液时其表面被剪切的风险。
2. 将 5–10 ml 预热的培养基倒入置于荧光体视显微镜下的解剖皿中。解剖皿的制备方法是：将一种名为 Sylgard 184 的弹性聚合物倒入 6 cm 塑料皿中，在真空条件下静置固化 1 周，使用前用大量水彻底冲洗。通常，我们会将这些皿在 1 L 烧杯的水中浸泡 1 周。
3. 通过颈椎脱位处死动物，并将头部切断。
   注意：如需要，可在取出脑组织前通过灌注生理盐水清除血管中的血液。若进行以二氨基联苯胺（DAB）为底物的显色免疫组化染色，此步骤尤为重要。
4. 沿头皮从前向后做正中切口，暴露颅骨。
5. 在颅骨上进行 4 次切割以打开颅腔：第一刀横跨两个眼眶，位于嗅球前方；接下来两刀位于小脑下方，将颅盖与颅底分离；最后一刀沿正中矢状缝从后向前切割。
6. 轻柔地牵开颅骨瓣，取出脑组织并放入解剖皿中。
7. 后续解剖操作在体视显微镜下进行。首先，将嗅球从脑组织上分离。若需进一步观察嗅球，可将其直接浸入 4% 多聚甲醛中固定过夜，随后可进行切片与染色处理。
8. 沿大脑半球间裂将脑组织分离为两半。
9. 在半球间裂的最尾端进行一次冠状面切割，以便在横断面上观察尾部海马结构。
10. 在此位置，海马构成侧脑室的内侧壁，而覆盖其上的皮层则构成脑室的背外侧壁。接下来需将海马从皮层下释放。首先，将刀尖插入背侧皮层与海马之间的微小脑室腔隙，然后在皮层向腹侧转折、远离中线并与海马连接处进行切割。完成此切口后，可缓慢将皮层从海马上剥离，从背侧向腹侧逐步暴露侧脑室。为加快操作，可在海马释放处的夹角位置切除一小块皮层组织。当剥离至该位置侧脑室最腹侧的边界时，可通过视觉或触觉判断皮层再次包绕并转向内侧与海马连接的位置。必须在此处再做一次切割，以完全将海马或侧脑室的内侧壁从皮层或侧脑室的外侧壁中分离。
11. 随后可轻松将海马向内侧和前侧牵拉，从而充分打开侧脑室。
12. 继续使用镊子和刀具进行小幅度操作，轻柔地向前牵拉海马，使内侧壁与外侧壁进一步分离。
13. 当牵拉阻力开始增加时，需进行额外切割。首先，为更好地暴露侧脑室，特别是其外侧壁和室管膜下区（SVZ），需将覆盖的皮层组织清除。通过观察胼胝体与室管膜区（VZ）/室管膜下区（SVZ）之间的界面，可干净地分离皮层组织。沿此界面切割时应保持在胼胝体一侧，以避免损伤 SVZ。
14. 为继续将内侧壁从外侧壁分离，还需进行两处切割：一处位于背侧，即外侧壁、内侧壁与皮层交汇处；另一处位于腹侧，即外侧壁、内侧壁与丘脑交汇处。完成上述切割后，进一步轻柔牵拉内侧壁，即可打开侧脑室最前端的部分。
15. 整个操作过程中，适当的照明至关重要，尤其是在下一步将内侧壁与外侧壁在前部分离时。在侧脑室的前部位置，内侧壁会向后折返并与外侧壁连续。调节照明角度，使两壁之间的阴影清晰显示这一折返点，该点在视觉上呈现为两壁之间的“山谷”。应精确在此“山谷”处进行切割，以分离两壁。
16. 最后，通过从背侧去除悬垂的皮层组织、从腹侧去除丘脑组织，完全暴露侧脑室的外侧壁。
17. 若准备用于免疫染色的整体样本，应小心将整体样本（脑室面朝上）从解剖皿转移至含有 4% 多聚甲醛（可含或不含 0.1% Triton-X100）的 24 孔板中，在 4°C 下固定过夜。对于对固定敏感的抗原，可缩短整体样本的固定时间。随后进入第 4 节，进行整体样本的免疫染色操作。
18. 若准备用于室管膜纤毛流分析的整体样本，应将整体样本转移至盛有新鲜 37°C Leibovitz 培养基的洁净解剖皿中，并进入下一节操作。

III. 使用荧光微珠进行室管膜流动分析

1. 使用两枚昆虫针将完整组织固定在干净的解剖皿中，一枚插入丘脑，另一枚插入组织前背侧角。
2. 将固定臂底座（用于固定显微操作器）放置在体视显微镜旁。确保可调臂的高度升至最高，以避免针头在操作过程中触碰解剖皿而折断。
3. 小心地将针尖浸入离心管中的培养液，以清除附着在针尖外表面的微珠。若未清除这些微珠，在后续针头定位过程中可能会意外沉积在完整组织表面，从而降低成像质量。
4. 将针尖置于侧壁背侧表面的上方，并降低操作臂使针尖进入液体中。针尖应下降至刚好接近侧壁表面的位置。
5. 针尖就位后，调节体视显微镜的放大倍数并聚焦，以覆盖所需的观察视野。若计划记录脑室管膜液流，此时应开始采集图像。
6. 向完整组织表面推出约 5 nl 的微珠溶液。一旦初始的微珠团块被脑室管膜液流清除出表面，可进行后续多次微珠注射。

IV. 免疫染色整体标本

1. 用于免疫染色的完整组织在4°C下用含或不含0.1% Triton-X100的4% PFA浸没固定过夜。对于能够耐受该处理的抗原，建议使用Triton-X100；但如果去垢剂会降低染色质量，则可省略。
2. 次日早晨，从24孔板中吸除PFA溶液，并用含或不含0.1% Triton-X100的0.1 M PBS对完整组织进行3次、每次5分钟的洗涤。如前所述，在本方案的所有洗涤步骤中，建议但非必须使用Triton-X100。在整个方案中，更换完整组织上的溶液时，需小心从孔的侧壁吸除溶液，然后使用移液管以倾斜角度向孔中重新加入溶液，使液体沿孔壁流下冲洗，避免直接冲击完整组织。操作过程中应始终确保完整组织的脑室面朝上。剧烈吹打液体常会导致完整组织翻转。我们建议每次仅更换一个完整组织的溶液，以防止组织干燥。
3. 洗去PFA后，将完整组织在封闭液中室温孵育1小时，封闭液为含10%正常山羊或驴血清的0.1 M PBS，可含或不含Triton-X100。若染色过程中使用Triton-X100，可在封闭液中选择使用2%或0.5%的Triton-X100。当检测需要抗体更深渗透至组织内部的抗原（如位于SVZ的抗原）时，我们使用2% Triton-X100；而当检测位于侧壁表面较浅位置的抗原（如室管膜细胞顶面的抗原）时，则使用0.5% Triton-X100。此外，对于会被去垢剂去除或改变的细胞表面或其他抗原，可省略Triton-X100。
4. 接下来，移除封闭液，加入用相同封闭液稀释的一抗，于4°C孵育24或48小时。孵育时间的选择取决于抗原特性，类似于选择0.5%或2% Triton-X100的情况。对于位于完整组织表面的抗原，24小时孵育已足够；而对于位于更深层（如SVZ）的抗原，48小时孵育可获得更佳结果。
   例如，为研究侧脑室壁衬细胞的顶面结构和基体，可用β-catenin抗体标记细胞膜，以及γ-tubulin抗体标记基体。将小鼠抗β-catenin抗体（1:500稀释）和兔抗γ-tubulin抗体（1:1000稀释）溶于含10%正常山羊血清和0.5% Triton-X100的0.1 M PBS中，于4°C孵育24小时。
   为标记成年神经干细胞（即B1型细胞），可用GFAP抗体对侧壁进行染色。将小鼠抗GFAP抗体（1:500稀释）溶于含10%正常山羊血清和2% Triton-X100的0.1 M PBS中，于4°C孵育48小时。
5. 首先用含或不含0.1% Triton-X100的PBS快速冲洗两次以去除一抗，随后在室温下再进行三次、每次20分钟的洗涤。
6. 将二抗用与一抗相同的封闭液稀释后加入完整组织中，于4°C孵育，孵育时间与一抗相同。
   例如，进行β-catenin和γ-tubulin染色时：将Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体（1:400稀释，识别小鼠抗β-catenin）和Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔抗体（1:400稀释，识别兔抗γ-tubulin）溶于含10%正常山羊血清和0.5% Triton-X100的0.1 M PBS中，于4°C孵育24小时。
   进行GFAP免疫染色时：将Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体（1:400稀释，识别小鼠抗GFAP）溶于含10%正常山羊血清和2% Triton-X100的0.1 M PBS中，于4°C孵育48小时。
7. 使用与去除一抗相同的洗涤步骤来洗去完整组织上的二抗。
8. 如有需要，可在室温下用PBS稀释的DAPI孵育30分钟进行核复染，随后用PBS洗涤一次。

V. 将免疫染色的整体样本装载到载玻片上以进行共聚焦显微镜观察

1. 为了进行高分辨率共聚焦成像，免疫染色后的全组织样本需进一步解剖，仅保留侧脑室侧壁约200–300 µm厚的一层薄片组织。将侧壁与下方的纹状体分离后，可将其平整地贴附于载玻片上，并加盖盖玻片。
2. 将免疫染色后的全组织样本及以下工具和设备带回体视显微镜：平头精细镊子、Sharpoint 22.5°显微外科穿刺刀、解剖皿、显微镜载玻片和盖玻片、0.1 M PBS缓冲液以及Aquamount封片介质。
3. 将全组织样本从24孔板转移至含有0.1 M PBS的解剖皿中，注意保持脑室面朝上。
4. 首先，从前向后完全切除全组织样本的背侧皮层，切口应精确沿胼胝体与侧壁交界处进行。该交界处表现为胼胝体白质与呈粉红色的室管膜下区（SVZ）之间的界面。
5. 接着，在全组织样本的腹侧做一条长的横向切口。此切面可为下一步解剖操作提供稳定平台，便于固定样本。
6. 将全组织样本背侧朝上放置，即可从前向后沿侧壁观察SVZ的厚度。请注意，由于先前已去除皮层，使得下方的纹状体和SVZ得以显露。SVZ表现为从脑室表面延伸至纹状体的一层均匀粉红色薄带组织，而纹状体则被白质纤维束穿插。需注意，SVZ在前部较厚，向后逐渐变薄。
7. 确定SVZ与纹状体的界面后，从侧壁最前端开始，沿该界面由背侧向腹侧小心切割。为准确操作，可用镊子作为两个固定针来稳定样本。也可用镊子轻微翻转样本，以便观察刀片从背侧向腹侧穿过侧壁的进程。本解剖步骤的关键在于最终获得的组织薄片必须非常平整。这意味着在沿侧壁从前向后切取SVZ时，所有切面必须始终与脑室表面保持平行。
8. 请注意，越向后方，SVZ越薄。然而，在向后推进解剖时，不应相应减薄切片厚度以仅切除SVZ，而应始终保持所切组织的厚度一致。这将确保后续用于封片的组织薄片保持平整。
9. 在完全分离侧壁与下方纹状体后，小心去除该薄片上不属于脑室壁的所有周围组织。
10. 然后用镊子从下方夹起该薄片，将其置于载玻片中央。在样本上直接滴加数滴Aquamount封片剂，轻轻将盖玻片居中覆盖其上，尽量避免在组织表面引入气泡。盖玻片的重量将促使Aquamount均匀扩散，从而使侧壁表面得到精细展平。所用Aquamount的量和盖玻片的尺寸取决于组织样本的年龄。对于胚胎期和早期出生后组织，推荐使用1滴Aquamount和22" × 30"的盖玻片；较重的盖玻片可能造成组织变形，过多的封片剂则会影响成像质量，因为共聚焦激光难以穿透盖玻片与组织间较厚的Aquamount层。对于晚期出生后及成年组织，则使用4滴Aquamount和24" × 60"的盖玻片。
11. 载玻片随后平放于载玻片盒中，在4°C下保存1–2天后再进行成像，以使盖玻片充分沉降。

代表性结果

整体组织制片方法为研究成年脑室下区（SVZ）的生发活性提供了若干关键见解。在对侧脑室侧壁进行整体组织制片并以多唾液酸化神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）抗体进行免疫染色后，首次观察到SVZ中迁移的新生神经元所形成的链状网络结构¹。这些迁移的成神经细胞链状结构也可通过双皮质素抗体对整体组织制片进行免疫染色而观察到（图1）。值得注意的是，该链状网络具有高度保守的模式，包含两条主要的细胞流：一条沿黏附点背侧上方延伸，另一条沿腹侧绕行。SVZ的整体组织制片还可全面展示该区域内前体细胞的增殖活性，如图2中Ki67染色所示。有趣的是，最近两项研究表明，SVZ分裂细胞与局部血管系统之间存在密切的相互作用^2,3（图2）。

在高倍共聚焦显微镜下观察时，全组织标本所提供的表面观可独特地展示衬于脑室系统腔面细胞的顶面结构。这种表面观最近揭示，SVZ的B1型细胞（成体神经干细胞）与不分裂的已分化室管膜细胞共同构成了一种混合性神经上皮⁴。B1型细胞的顶面与侧脑室腔相接触，并被室管膜细胞较大的顶面以“风车样”结构所包围（图3，箭头指示B1细胞的顶面）。此外，对室管膜细胞顶面的细致观察发现，其基体的平移位置和旋转方向可反映其平面极性⁵。室管膜细胞的基体在顶面上聚集形成一个区域，该区域相对于脑脊液流动方向偏向“下游”侧，偏离顶面中心（即平移极性）；在此区域内，每个基体围绕其长轴发生旋转，使得基体附属结构——基足——指向脑脊液流动方向（即旋转极性）。相邻的室管膜细胞其基体均朝向相同的方向。重要的是，室管膜流动实验的录像显微图像可用于直接比较侧脑室壁特定区域的脑脊液流动方向与该区域室管膜细胞基体的排列方向（图4）。

除了提供成年大脑中最大生发区域的全景视角外，通过高倍成像，全组织标本还可实现对侧脑室下区（SVZ）单个细胞形态更完整且更详细的分析。对全组织标本进行GFAP免疫染色的高倍共聚焦成像揭示，B1型细胞除了具有较短的、与脑室接触的顶突外，还拥有一条与血管接触的长基底突起（图5）⁴。这种细胞结构在冠状切片中此前未被充分认识，因为基底突起主要与脑室壁平行走行。因此，连续切片会将单个细胞切割成多个小片段，几乎无法重建细胞的完整形态，也无法理解其与其他SVZ细胞类型之间的关系。全组织标本技术相较于传统的切片方法具有多项优势，既可通过低倍显微镜提供全景视图，也可通过高倍显微镜获得单个细胞的完整形态信息。该技术将继续作为未来研究成年大脑生发区的重要补充手段。

图 1. 室管膜下区（SVZ）中迁移性神经元链网络。拼接的共聚焦图像重建了经双皮质素（doublecortin）抗体染色的侧壁全层制片，该蛋白可标记贯穿室管膜下区的迁移性成神经细胞。存在两条主要的迁移通路：一条沿粘附点背侧上方走行，另一条沿腹侧绕行，粘附点由星号（*）标示。箭头指示前（a）和背侧（d）方向。比例尺 = 1 mm。

图 2. SVZ中血管系统与分裂细胞之间的关系。该侧壁全层标本经免疫染色，使用Ki67抗体标记绿色的分裂细胞，以及抗小鼠免疫球蛋白抗体标记红色的血管系统。由于该全层标本在染色前未用生理盐水灌注，内源性小鼠IgG分子仍保留在血管内，并被二抗抗小鼠抗体所染色。近期研究表明，分裂中的SVZ前体细胞（绿色）位于血管（红色）附近{Shen, 2008 #6523}{Tavazoie, 2008 #6522}。箭头指示前（a）和背侧（d）方向。比例尺 = 1 mm。

图3. 侧壁上与脑室接触的细胞的顶面。对全 mount 样品进行免疫染色，其中β-连环蛋白用于绿色标记细胞膜，γ-微管蛋白用于红色标记基体，该高倍共聚焦图像揭示了这些上皮细胞的平面排列结构。B1型细胞是成年神经干细胞，具有较小的顶面，其上仅有一个基体，由箭头指示。这些细胞的顶面被室管膜细胞较大的顶面以风车样结构包围。室管膜细胞表现出平面极性，表现为多个基体在顶面上的位置具有方向性。相邻室管膜细胞的基体簇位于顶面的同一侧（在此区域为向下并向左），这与脑脊液流动方向一致 {Mirzadeh, 2010 #6573}。比例尺 = 10 μm。

图4. 脑室管膜细胞流体实验。该复合图像由脑室管膜流体实验过程中拍摄的视频中连续100帧图像合并而成。沉积于黏附区域背侧及后侧的荧光微珠，在脑室管膜纤毛的驱动下，形成两条方向性流束，分别从黏附区域的上方和下方流向Monro孔。这种定向流动揭示了脑室管膜细胞的功能性平面极性。每条流线表示单个微珠在连续时间点的位置。比例尺 = 0.5 mm。

图5. GFAP阳性B1型细胞具有延伸至血管的长基底突起。该图是侧壁全层标本经GFAP抗体免疫染色后，通过高倍共聚焦显微镜成像获得的图像最大投影，用于标记脑室下区（SVZ）的星形胶质细胞。该染色可标记成年神经干细胞，即B1型细胞，这类细胞在脑室表面具有顶端终末，同时如本图所示，还具有一条长的GFAP阳性基底突起，其末端终止于血管（箭头所示）。此处血管被染色的原因在于，用于检测小鼠抗GFAP一抗的二抗可识别血管系统内源性的小鼠IgG。比例尺 = 50 μm。

讨论

大多数关于脑室区和室下区神经发生的研究依赖于传统的切片技术，以观察这些区域的微细解剖结构和细胞间关系。本文介绍一种替代性技术，该技术最初用于分析室下区（SVZ）产生的成神经细胞迁移链网络¹，随后被用于研究抗有丝分裂治疗后SVZ前体细胞群体的再生⁶，最近则被用于研究成年SVZ神经干细胞精确的顶端和基底细胞间相互作用^2,3,4。有趣的是，该技术揭示成年SVZ的神经干细胞（即B1型细胞）与已分化的非分裂性室管膜细胞共同构成一种混合性神经上皮。通过整体标本的表面成像发现，这种混合性神经上皮具有“风车样”结构，即B1型细胞的顶端末端被室管膜细胞较大的顶端表面所包围⁴。这种表面分析方法深化了我们对胚胎和成年脑中神经干细胞谱系的理解，即这些细胞具有位于脑室表面的顶端末端，并通过基底突起与血管微环境相接触。这些发现若采用传统切片技术几乎无法实现。整体标本还有助于通过神经干细胞与脑室相接触的顶端突起来识别这些细胞。随着针对这些干细胞更特异性标记物的发现，整体标本技术将成为识别和分析神经干细胞行为不可或缺的一部分。

侧脑室壁的整体装片也为研究室管膜细胞的平面极性提供了理想视角。室管膜细胞是多纤毛细胞，排列于脑室表面，其功能是以协调的方式推动脑脊液流动。通过整体装片技术，可完整暴露整个室管膜上皮的表面，从而能够从其前到后、背侧到腹侧边界进行全面的染色与研究。此外，在急性分离的活体整体装片上进行的室管膜流动实验，可强有力地展示由室管膜纤毛产生的平面极化流动。近期利用整体装片方法的研究已揭示了这种室管膜平面极性的细胞决定因素⁵。有趣的是，整体装片研究还提示，室管膜产生的脑脊液流动建立了化学排斥物的梯度，从而引导脑室下区（SVZ）新生神经元的迁移⁷。因此，最初用于发现迁移性神经元链网络的整体装片方法，正在持续为揭示调控链式迁移的机制提供新的见解。

通过整体成像对脑室区（VZ）和室下区（SVZ）进行分析，为未来的研究提供了一种新方法，同时也为澄清现有研究的理解提供了途径。例如，最近一项研究提出，成年SVZ中的神经干细胞是与脑室接触的CD133+/CD24-细胞⁸。基于他们在组织切片中的免疫染色结果，这些作者声称这些细胞是多纤毛室管膜细胞的一个亚群。然而，在我们采用整体成像方法的研究中，由于该方法能够更全面地观察整个室管膜上皮，我们发现所有室管膜细胞均表达CD24，而唯一表现为CD133+/CD24-并与脑室接触的细胞是B1型细胞的一个亚群⁴。此外，整体成像技术有望在今后研究成年大脑中神经干细胞最近被描述的镶嵌式组织结构时发挥重要作用⁹。多项研究表明，成年大脑中的神经干细胞并非均一的细胞群体，而是具有区域特异性，通常仅产生特定亚型的嗅球中间神经元。这些研究提出，不同亚群的神经干细胞可能通过特异性转录因子的表达^{10,11,12,13,14}和/或其在侧壁背腹向及前后向区域的定位差异加以区分^9,15,16。随着更多用于标记成年神经干细胞区域特异性亚群的分子标志物被鉴定出来，整体成像技术应能提供一个全面的视角，揭示这些不同前体细胞区域沿脑室壁的分区分布情况。

本文介绍的整体解剖与成像技术也可用于分析胚胎中的脑室壁。胚胎侧壁的解剖以相同的步骤逐步进行，仅在操作难度上略有差异：胚胎脑室相对较大，使解剖更为容易，但组织较软，导致操作更为困难。特别是，在胚胎中可通过类似的侧脑室暴露方法来解剖脑室的皮质壁，以研究皮质神经发生。近期证据表明，在皮质神经发生过程中，中心体的不对称遗传可维持放射状胶质细胞位于脑室表面¹⁷。对放射状胶质细胞顶面进行正面成像，可能有助于揭示这些分裂细胞中中心体如何实现不对称遗传。

与大多数技术一样，尤其是涉及精细操作的技术，熟练掌握需要练习。然而，在解剖过程中有几点关键因素有助于获得更好的结果：1）照明——调节样品的光照以产生阴影，可在原本相对均一的组织解剖过程中提供极为宝贵的对比度；2）使用镊子如同使用两根昆虫针——本技术中从不用镊子夹捏或提起组织，而是将其作为可灵活移动的固定针，能够在切割过程中持续调整以稳定组织；3）轻柔牵拉与切割之间的平衡——刀具不仅用于切割，还应提供轻柔的牵拉以分离内侧壁与外侧壁，需记住，该解剖过程主要依靠轻柔牵拉完成，仅间歇性地进行切割。