切片标本免疫组织化学染色的薄切片制备

摘要

本方法可实现对体积小、难以处理的组织样本（如活检组织和脑切片）进行可重复的冰冻切片。我们采用一种简单的铝制冷冻台以方便组织操作，并使用标准冰冻切片机， routinely 制备厚度为 400 微米的脑切片上连续 5-10 微米的切片。

摘要

神经科学及其他学科的许多研究涉及对已保存、新鲜移除或切除后仍保持活性的小型宏观组织样本或组织切片（如脑组织切片制备物）进行研究。对这类材料进行后续显微分析可能具有挑战性，因为组织样本往往难以操作。本文演示了一种获取厚度在0.2–5.0 mm范围内的冷冻切片的方法。我们常规将400微米厚的Vibratome脑切片连续切割为5–10微米厚的冠状冷冻切片。这些切片通常首先用于电生理学实验，随后需要对记录区域的细胞构筑进行显微分析。我们设计了一种简易装置，可实现组织切片的可控且可重复的制备与定位。该装置由一根长5 cm、直径1.2 cm的圆柱体构成，用作切片的冷冻平台。一个环形套筒紧密套在圆柱体外，形成围绕切片的侧壁，使组织可浸入包埋剂（如OCT）中。随后使用粉碎的干冰快速冷冻，所得组织薄片可轻松定位并用于冷冻切片。薄切片可贴附于涂覆载玻片上，以便进一步开展各种染色方法、原位杂交或免疫组织化学等研究，如本文所示。 关键词：冷冻切片，脑切片，OCT包埋剂，电生理学，细胞构筑，免疫组织化学，原位杂交，Vibratome切片，组织处理，显微分析

方案

1. 用胶带制备用于OCT平台的模具。
2. 在模具中填充OCT，然后在冷冻切片机内或使用碎干冰进行冷冻。
3. 从冻结的OCT平台周围移除胶带。
4. 对齐冷冻夹持器和冷冻切片机安装台上的标记，并将夹持器锁紧。
5. 对OCT平台进行切片，直至表面平整。
6. 取下修平后的OCT平台，放置于冷冻切片机的冷冻台上。
7. 将组织样本（先前已在含30%甘油或蔗糖的PBS中冷冻保存）放入OCT中。
8. 准备一个冷冻柱，其外环高出柱顶约5 mm，形成用于容纳OCT的凹槽。
9. 小心地将组织样本置于冷冻柱表面中心位置，并缓慢加入OCT直至填满凹槽。
10. 用碎干冰包围冷冻柱。组织和OCT应在20–60秒内完全冻结。
11. 随着样品温度逐渐升高，可在样本仍保持冻结状态时移除外环。
12. 将样本从冷冻柱上侧向滑下，并放入冷冻切片机中。
13. 在OCT平台表面滴加一滴OCT，将标本（组织面朝下）放置其上并施加稳固压力。标本将迅速冻结固定于OCT平台上。
14. 将夹持器固定在冷冻切片机安装台上，确保标记对齐。
15. 对位于组织标本上方的OCT部分进行切片。
16. 将薄切片解冻贴附于玻璃载玻片上，可冷冻保存或室温存放。
17. 可对贴附于玻璃载玻片上的组织进行免疫反应操作。
18. 将试剂滴加于载玻片上，可轻轻振荡，若对光敏感则可加盖避光。
19. 后续反应步骤可通过将载玻....

讨论

本文提供的实验方案为研究人员简明扼要地概述了如何获取难以处理的小型组织样本（如活检组织和脑切片）的薄冰冻切片，以便后续进行各种染色方法、原位杂交或免疫组织化学等研究。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
O. C. T.	Ted Pella, Inc.	27050
甘油溶液			30% Glycerol Solution in PBS w/v
蔗糖溶液			30% Sucrose Solution in PBS w/v