实验性转移检测

摘要

本文描述了一种用于测定人癌细胞系转移潜能的实验性转移检测方法的操作步骤。

摘要

转移是癌症患者死亡的主要原因。为了理解转移的机制，研究人员建立了利用免疫缺陷小鼠的实验性转移检测方法。本文详细说明了该检测中的各项操作步骤，包括样本制备、静脉注射以及从肺转移灶中培养细胞。简而言之，预先确定数量的人类癌细胞被制备in vitro并通过尾静脉直接注入免疫缺陷小鼠的循环系统。少量细胞能够存活于血液循环的湍流环境中，并在肺等内脏器官中形成转移灶。注射一定时间后，解剖小鼠，利用解剖显微镜确定转移灶在组织中的分布情况。计数特定组织中转移灶的数量，该数量与所注射癌细胞的转移能力直接相关。将形成的转移灶分离并进行培养in vitro细胞系在再次注射到免疫缺陷小鼠体内时，通常表现出比亲本细胞系更强的转移能力。这些高转移性衍生细胞系成为识别调控转移进展相关基因或分子通路的有力工具。

方案

1. 样品制备

1. 在含有生长因子或胎牛血清（FBS）的特定培养基中（例如，MC-1 细胞使用含 10% FBS 的 DMEM）将细胞培养至约 70% 汇合度。吸除培养板中的培养基，并用 1 × PBS（8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.15 g/L Na₂HPO₄·7H₂O、0.2 g/L KH₂PO₄，pH 7.3）轻轻洗涤数次。
2. 吸除 PBS，加入 2 mL 含 0.05% 胰蛋白酶的 versene 溶液（含 0.014 g/L 酚红和 0.2 g/L EDTA-Na 的 1 × PBS，pH 7.2）。轻轻摇动培养板以促进细胞从板底脱落。在显微镜下观察细胞，通常需要 2–5 分钟细胞即可脱落。
3. 加入足量含 FBS 的培养基（或大豆胰蛋白酶抑制剂）以终止胰蛋白酶活性，并将细胞收集至 50 mL Falcon 离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。取 10 μL 细胞悬液滴加到清洁的血细胞计数板上。每毫升细胞数等于五个大方格中每个方格的平均细胞数乘以 10⁴。
4. 在台式离心机中以 1000 RPM（或约 200 ×g）离心 3 分钟。
5. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用适量的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）重悬细胞，使其最终浓度约为 5 × 10^6<....

讨论

转移是癌症患者死亡的主要原因。它包括四个主要步骤：癌细胞从原发部位脱落、进入循环系统（内渗）、离开循环系统（外渗）以及在远端器官中存活并增殖。在人体中，转移被认为是一个缓慢的过程，通常在多年潜伏期后才显现。为了及时研究其进展，已在免疫缺陷小鼠中建立了上述相对较快的实验方法⁴。自建立以来，该方法已被有效用于分离具有不同转移能力的细胞，鉴定在转移过程中上调或下调的基因^1,2,5，并验证这些基因在转移过程中的因果作用³。

该实验中最困难的步骤是将细胞注入尾静脉。掌握注射技术需要反复练习。即使是经验丰富的研究人员，通常也需要经过数次尝试才能成功完成注射。小鼠尾部的静脉非常细，将针头准确插入静脉正中央并不容易。注射前使用灯短暂加温尾部并轻轻按摩，可促使血管扩张，从而有助于注射。大多数研究人员常犯的一个错误是认为静脉位于尾部较深的位置，因而将细胞注射得过深。实际上，静脉非常靠近皮肤表面，因此应尽可能进行浅层注射。

如果针头成功插入静脉内，注射过程应顺畅无阻力。如.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	10313-021
FBS	Hyclone	SH30088.03
HBSS	Invitrogen	14175-095
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6838-04
Na2 HPO4.7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	7896-04
KH2PO4	Mallinckrodt Baker Inc.	7100-12
酚红	Sigma-Aldrich	P3532
EDTA-Na	EMD Millipore	4010
台盼蓝	Invitrogen	15250-061
2.5% 胰蛋白酶	Invitrogen	15090-046
乙醇	Ultrapure	200-CSGP
50 ml Falcon 离心管	VWR international	89039-656
微量离心管	Axygen Scientific	MCT-175-C
Falcon 70μm 细胞筛	BD Biosciences	352350
5 ml Falcon 培养管	VWR international	60818-576
血细胞计数板	Hausser Scientific	15170-208
1 ml 注射器	BD Biosciences	329650
30 ½ 号针头	BD Biosciences	305106
小鼠固定器	Plas Labs Inc.	551-BSRR
手术剪刀	Fisher Scientific	08-940
镊子	Fisher Scientific	08-902
解剖显微镜	Nikon Instruments	SMZ1500
台式离心机	Thermo Fisher Scientific, Inc.	75003491