实验性转移检测

摘要

本文描述了一种用于测定人癌细胞系转移潜能的实验性转移检测方法的操作步骤。

摘要

转移是癌症患者死亡的主要原因。为了理解转移的机制，研究人员建立了利用免疫缺陷小鼠的实验性转移检测方法。本文详细说明了该检测中的各项操作步骤，包括样本制备、静脉注射以及从肺转移灶中培养细胞。简而言之，预先确定数量的人类癌细胞被制备in vitro并通过尾静脉直接注入免疫缺陷小鼠的循环系统。少量细胞能够存活于血液循环的湍流环境中，并在肺等内脏器官中形成转移灶。注射一定时间后，解剖小鼠，利用解剖显微镜确定转移灶在组织中的分布情况。计数特定组织中转移灶的数量，该数量与所注射癌细胞的转移能力直接相关。将形成的转移灶分离并进行培养in vitro细胞系在再次注射到免疫缺陷小鼠体内时，通常表现出比亲本细胞系更强的转移能力。这些高转移性衍生细胞系成为识别调控转移进展相关基因或分子通路的有力工具。

方案

1. 样品制备

1. 在含有生长因子或胎牛血清（FBS）的特定培养基中（例如，MC-1 细胞使用含 10% FBS 的 DMEM 培养基）将细胞培养至约 70% 汇合度。吸除培养板中的培养基，并用 1 × PBS（8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.15 g/L Na₂HPO₄·7H₂O、0.2 g/L KH₂PO₄，pH 7.3）轻轻洗涤数次。
2. 吸除 PBS，加入 2 mL 含 0.05% 胰蛋白酶的 versene 溶液（含 0.014 g/L 酚红和 0.2 g/L EDTA-Na 的 1 × PBS，pH 7.2）。轻轻摇动培养板以促进细胞从板底脱落。在显微镜下观察细胞，通常需要 2–5 分钟细胞即可脱落。
3. 加入足量含 FBS 的培养基（或大豆胰蛋白酶抑制剂）以终止胰蛋白酶活性，并将细胞收集至 50 mL Falcon 管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。取 10 μL 细胞悬液加入洁净的血细胞计数板上。每毫升细胞数等于五个大方格中每个方格的平均细胞数乘以 10⁴。
4. 在台式离心机中以 1000 RPM（或约 200 ×g）离心 3 分钟。
5. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用适量的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）重悬细胞，使其最终浓度约为 5 × 10⁶ 个细胞/mL。
6. 通过 Falcon 70 μm 细胞筛过滤细胞，以去除大的细胞团块。将移液器尖端直接置于标记好的 5 mL Falcon 培养管上方的滤膜上，迅速将悬液推过滤膜进入培养管。
7. 再次使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将其稀释至最终浓度为 2.5 × 10⁶/mL。将细胞置于冰上保存。
8. 测定细胞活力。取部分细胞与台盼蓝混合，使用血细胞计数板测定蓝色（死亡）细胞占总细胞的百分比。注射前细胞活力应 ≥ 90%。

2. 静脉注射

1. 更换手套。轻轻抓住一只免疫缺陷小鼠（裸鼠、NOD-SCID 或 NSG，Jackson 实验室）的尾巴，将其拉入小鼠固定器中，使小鼠背部紧贴狭缝，尾巴从小固定器后部的小开口伸出。
2. 沿狭缝缓慢将环向内滑动，当环卡住小鼠口部时将其锁定。小鼠不应能自由活动，但应保持正常的呼吸频率。
3. 找到尾部主要静脉。小鼠尾巴内有四条主要血管。位于尾巴背侧和腹侧的血管为动脉，静脉则位于尾巴的两侧。
4. 将超过 200 μL 的制备好的细胞吸入 1 mL 注射器中。安装 30 G 1/2 英寸针头，并排出所有可能存在的气泡。注射器中细胞的最终体积应为 200 μL（即总共 5 × 10⁵ 个细胞）。
5. 将细胞注入尾静脉。
   1. 从尾巴远端开始注射，以便在首次尝试失败时，可使用更近端的区域进行第二次尝试。
   2. 用 70% 乙醇擦拭尾巴，将尾巴拉直。用拇指夹住尾尖，用食指支撑注射部位。
   3. 将针头插入静脉并注射细胞。确保注射过程中针头和注射器与静脉平行，否则针头可能刺穿血管壁，将细胞注入周围尾部组织中。
   4. 注射后拔出针头。若注射成功，注射部位应有血液渗出。用干净的纸巾或棉签按压注射部位以促进凝血，并自下而上轻柔按摩尾巴，推动静脉内残留的样品进入循环。
   5. 将小鼠从小鼠固定器中释放并放回笼中。在实验记录本中记录注射过程（例如，注射细胞所用的尝试次数以及注射的细胞量）。
   6. 按照样品制备部分第 9 步所述，测定注射后细胞的活力。此步骤可确认细胞在整个注射过程中保持存活。在注射实验结束时，细胞活力可能会有所下降，但仍应高于 80%。
   7. （可选）将剩余细胞离心，用 PBS 洗涤沉淀一次，然后将沉淀在 -80 °C 冻存，用于后续分析（例如，通过 Western blot 检测基因表达或基因敲低效果）。
6. 通常在一个月或两个月后，对小鼠进行解剖，肉眼确定转移灶的位置。肺是主要的转移部位，因为当细胞进入循环系统后，肺是其遇到的第一个毛细血管床。
7. 用 PBS 冲洗后，在解剖显微镜下观察肺的每个叶（或其他含有转移灶的组织）（图 1）。计数肺两侧可检测到的转移灶数量，并将四个肺叶上的肺转移灶数目相加，得到肺转移灶总数¹。若将肺组织在福尔马林中固定过夜，则更易于检测肺转移灶，因为转移灶会呈现为与周围深棕色肺组织形成对比的灰白色斑点。

3. 肺转移灶来源细胞的培养

1. 从注射的小鼠中分离肺转移灶。每个转移灶应单独培养。
2. 使用无菌针帽末端在70 μm细胞筛网上将每个转移灶切碎。
3. 用数毫升培养基冲洗细胞筛网，并收集滤过筛网的细胞至培养皿中。
4. 将细胞在37 °C条件下孵育至少四天，期间避免扰动。
5. 用PBS洗去培养皿中的血液或组织碎片。
6. 加入新鲜培养基。初期，癌细胞和成纤维细胞均会在培养板上生长，但随着时间推移，成纤维细胞将逐渐死亡并被癌细胞取代。如果癌细胞携带任何药物抗性基因，可使用相应的抗生素进行筛选。
7. 通过使用针对人特异性蛋白的抗体进行免疫染色，评估所获得细胞的纯度。我们使用抗人波形蛋白抗体（NCL-VIM-V9, Novocastra）。所获得的细胞通常含有人源细胞比例超过99%，即使未进行药物筛选亦如此。新获得的细胞可再次注射至免疫缺陷小鼠体内，以检测其转移能力，方法如上所述。

4. 代表性结果

1. 在本实验结束时，高转移性癌细胞系通常会产生大量肺转移灶（图1）¹，而低转移性癌细胞系则几乎不形成肺转移灶。
2. 使用该方法获得的细胞在再次通过本实验检测时，通常比亲本细胞系产生更多的转移灶^1-3。

图1. 小鼠尾静脉注射癌细胞后肺组织的代表性图像。将5 × 10⁵个转移性人黑色素瘤细胞系SM细胞⁴注射至免疫缺陷小鼠的尾静脉中。两个月后，分离肺组织，发现转移灶散在于正常肺组织中。

讨论

转移是癌症患者死亡的主要原因。它包括四个主要步骤：癌细胞从原发部位脱落、进入循环系统（内渗）、离开循环系统（外渗）以及在远端器官中存活并增殖。在人体中，转移被认为是一个缓慢的过程，通常在多年潜伏期后才显现。为了及时研究其进展，已在免疫缺陷小鼠中建立了上述相对较快的实验方法⁴。自建立以来，该方法已被有效用于分离具有不同转移能力的细胞，鉴定在转移过程中上调或下调的基因^1,2,5，并验证这些基因在转移过程中的因果作用³。

该实验中最困难的步骤是将细胞注入尾静脉。掌握注射技术需要反复练习。即使是经验丰富的研究人员，通常也需要经过数次尝试才能成功完成注射。小鼠尾部的静脉非常细，将针头准确插入静脉正中央并不容易。注射前使用灯短暂加温尾部并轻轻按摩，可促使血管扩张，从而有助于注射。大多数研究人员常犯的一个错误是认为静脉位于尾部较深的位置，因而将细胞注射得过深。实际上，静脉非常靠近皮肤表面，因此应尽可能进行浅层注射。

如果针头成功插入静脉内，注射过程应顺畅无阻力。如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	10313-021
FBS	Hyclone	SH30088.03
HBSS	Invitrogen	14175-095
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6838-04
Na2 HPO4.7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	7896-04
KH2PO4	Mallinckrodt Baker Inc.	7100-12
酚红	Sigma-Aldrich	P3532
EDTA-Na	EMD Millipore	4010
台盼蓝	Invitrogen	15250-061
2.5% 胰蛋白酶	Invitrogen	15090-046
乙醇	Ultrapure	200-CSGP
50 ml Falcon 离心管	VWR international	89039-656
微量离心管	Axygen Scientific	MCT-175-C
Falcon 70μm 细胞筛	BD Biosciences	352350
5 ml Falcon 培养管	VWR international	60818-576
血细胞计数板	Hausser Scientific	15170-208
1 ml 注射器	BD Biosciences	329650
30 ½ 号针头	BD Biosciences	305106
小鼠固定器	Plas Labs Inc.	551-BSRR
手术剪刀	Fisher Scientific	08-940
镊子	Fisher Scientific	08-902
解剖显微镜	Nikon Instruments	SMZ1500
台式离心机	Thermo Fisher Scientific, Inc.	75003491