使用自制细胞离心涂片装置对人类多能干细胞进行免疫细胞化学分析

摘要

基于自制的细胞离心装置制备细胞单层，从而实现对人多能干细胞（hPSCs）表面标志物（SSEA-3/SSEA-4）进行悬浮免疫细胞化学染色，以便观察与定量分析。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），因其无限的自我更新能力以及分化为多种细胞类型的潜力，成为极具前景的细胞来源。hPSCs的多能性状态通常通过qPCR、免疫细胞化学以及其他技术进行评估。in vitro和in vivo可分化为多种细胞类型。其中，免疫细胞化学技术已发展用于常规鉴定hPSCs的未分化状态，主要基于候选细胞内及细胞表面生物标志物的分析。由于hPSCs以集落形式生长，在常规基础上对单个细胞水平的这些标志物表达进行定量时存在困难。流式细胞术分析可解决此问题，但需要较多细胞数量及试剂用量，通常不适用于hPSC培养的常规质量控制评估。因此，开发实用且可重复的方法以制备保持完整性的单层细胞样本用于标志物检测，在干细胞研究中具有诸多优势。这将极大促进免疫细胞化学分析，因为可方便地观察和定量单层中的单个细胞对特定标志物的表达。为实现这一目标，本研究构建并优化了一种自制的细胞离心涂片装置，适用于免疫细胞化学染色。本方案以一种变异型BG01干细胞系为例，分析了两种细胞表面标志物（SSEA3/SSEA4）的表达。

方案

第1部分：悬浮免疫细胞化学染色

1. 将细胞收集至单细胞悬液中。
2. 然后将细胞转移至1.5–2 mL微量离心管中，在200g条件下离心4分钟。
3. 通过吸除上清液，加入1 mL不含Mg²⁺和Ca²⁺的PBS--重悬细胞，再在200g条件下离心4分钟，洗涤一次。此步骤应重复两次。
4. 洗涤后，在室温下用1 mL 4%多聚甲醛（PFA）重悬细胞，固定10分钟。
5. 细胞再用1 mL PBS--洗涤两次。
6. 洗涤后，用1 mL封闭液（6%血清/94% PBS--）重悬细胞进行封闭，在室温下孵育45分钟。
7. 随后，在200g条件下离心4分钟，吸除封闭液，用1 mL一抗溶液（用封闭液按推荐稀释比例配制）重悬细胞。细胞可在室温下孵育1小时，或在4°C过夜，之后进入下一步。
8. 然后用1 mL封闭液洗涤细胞两次。
9. 之后，用1 mL二抗溶液（用封闭液按推荐稀释比例配制）重悬细胞，在室温下孵育1小时。
10. 1小时后，再用1 mL封闭液洗涤细胞两次。
11. 用封闭液洗涤后，再用1 mL PBS--洗涤细胞一次。
12. 经过上述各次洗涤后，用1 mL DAPI核染液（DAPI以1:10,000比例稀释于PBS--中）重悬细胞，在室温下孵育5分钟。
13. 5分钟后，在200g条件下离心4分钟，吸除DAPI染液，用1 mL PBS--重悬细胞。

第2部分：通过细胞离心涂片仪将人多能干细胞掺入载玻片

1. 使用台式钻床在塑料载片上钻出所需数量的孔，孔的直径应比所用微移液管尖端的最大直径最多大1 mm。
2. 用剪刀将滤纸裁剪至与塑料载片相同的尺寸。
3. 随后在滤纸上打孔，孔的大小应足以使微移液管尖端紧密穿过。
4. 之后，将一块准备好的塑料载片置于滤纸顶部，玻璃载片置于底部（图1）。用胶带固定各层。
5. 然后，将第1部分中染色后的细胞悬液最多100μL（根据所需的单层细胞密度而定）加入微移液管尖端顶部。
6. 如有必要，可对含有细胞溶液的装置进行称重，并制备一个重量相近的配重作为平衡物。
7. 将细胞离心装置和配重一同放入台式离心机，以200g离心4分钟。
8. 离心结束后，小心拆卸细胞离心装置，避免细胞从玻璃载片上脱落。
9. 如有必要，用移液器吸除玻璃载片周围多余的PBS液体。
10. 随后可使用荧光显微镜观察细胞，以确认是否已获得理想的单层细胞分布。

第3部分：载玻片封片

1. 将一滴所需的封片介质直接置于每个含有细胞的区域中央。
2. 随后，轻轻将盖玻片盖在载玻片上，尽量避免产生气泡。
3. 然后从载玻片上去除多余的封片介质。
4. 接着，用指甲油密封盖玻片的四周。
5. 载玻片可存放于避光的储存区域，直至观察并记录结果。

讨论

在本实验室的操作中，将一皿35 mm的在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养的干细胞用于免疫细胞化学染色，并配合细胞离心涂片装置使用。通过酶消化传代的方法收集细胞，尽可能去除MEF层，制成单细胞悬液。若需更有效地从MEF层中分离干细胞，可先手动挑选克隆，再消化为单细胞悬液。若干细胞培养采用无饲养层条件，则可直接将克隆刮下并消化为单细胞悬液。尽管初始的单细胞悬液最为理想，但在免疫细胞化学染色过程中多次的洗涤和重悬步骤应能有效打散任何存在的细胞团块。

本视频重点介绍了使用细胞外标记物对人多能干细胞（hPSCs）进行染色的方法。如果需要对hPSCs进行细胞内染色，则在加入封闭液（步骤1.6）之前需增加一个步骤：用通透化溶液（50 mL高盐缓冲液加25 μL Tween 20）将细胞洗涤三次，每次1 mL，然后再将细胞重悬于封闭液中。另一个需要强调的关键点是，从步骤1.9开始，在整个操作过程中应尽量减少样品暴露于光照，以防止二抗和DAPI核染料发生荧光淬灭。

由于该实验流程包含多次洗涤和重悬步骤，建议使用一个含有足量可传代干细胞集...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lab Tek Permanox 培养皿载玻片	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	可重复使用的塑料载玻片材料
Superfrost/Plus 预清洁显微载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL 滤芯吸头	USA Scientific, Inc.	1121-3810
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	封片介质
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
正常山羊血清	Invitrogen	10000C
小鼠抗 SSEA-4 单克隆抗体	EMD Millipore	MAB4304	SSEA-4 染色用一抗
大鼠抗 SSEA-3 单克隆抗体	EMD Millipore	MAB4303	SSEA-3 染色用一抗
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	A11029	SSEA-4 染色用二抗
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗大鼠 IgG	Invitrogen	A11006	SSEA-3 染色用二抗
DAPI 二盐酸盐	Calbiochem	268298