慢性 Salmonella 感染小鼠模型

摘要

建立具有持续性慢性细菌感染的小鼠模型 沙门氏菌 肠道中鼠伤寒沙门氏菌定植持续27周。

摘要

细菌感染小鼠模型是研究感染、炎症、免疫学、信号转导以及肿瘤发生等领域的一种强大模型系统。许多研究人员已利用由结肠炎所诱导的Salmonellatyphimurium 进行炎症和感染早期阶段的研究。然而，关于慢性感染的报道却很少。in vivo. 小鼠具有Salmonella胃肠道中的持续存在使我们能够探索长期的宿主-细菌相互作用、信号转导以及肿瘤发生过程。我们已建立了一种慢性细菌感染的小鼠模型，用于Salmonella沙门氏菌在小鼠肠道内定植长达6个月。使用该系统需要研究人员掌握细菌培养物的制备以及对动物进行灌胃的技术。我们详细描述了制备细菌培养物和对小鼠进行灌胃的方法。同时，我们也展示了如何检测Salmonella在胃肠道中的持续存在。总体而言，本方案将有助于研究人员利用细菌感染小鼠模型来解答具有根本重要性的生物学和微生物学问题。

方案

本方案包括三个部分：细菌培养、小鼠灌胃和 沙门氏菌 检测

1. Salmonella 生长条件。

1. 准备 沙门氏菌 Luria-Bertani 肉汤（LB）平板，37°C 培养过夜。
2. 从LB平板上挑取一个克隆，放入含有7 ml LB培养基的12 ml离心管中，37°C振荡培养约5小时。
3. 接种50 ml LB培养基，加入0.05 ml对数期末期培养物，在37°C下静置培养约18小时。
4. 将过夜培养的细菌在室温下以6000 rpm离心10分钟，用HBSS按100:3（LB: HBSS）的比例重悬细菌。例如：
   每50 ml LB培养物将悬浮于1.5 ml HBSS中。
5. 对于动物灌胃，将细菌培养物进一步按1:10比例稀释。例如：
   每1.5 ml LB培养物将悬浮于15 ml HBSS中。

2. Salmonella感染模型*。

1. 配制链霉素溶液。每只小鼠给予7.5 mg链霉素溶于100 μl HBSS中。例如，为10只小鼠配制总量为90 mg链霉素溶于1.2 ml HBSS的溶液。配制链霉素溶液时，应始终多准备一些体积。
2. 在口服灌胃处理前4小时停止供应饮水和食物。
3. 通过灌胃法给予小鼠7.5 mg链霉素（对照小鼠给予100 μl HBSS）。用拇指和中指牢固抓住小鼠肩部皮肤，用食指伸直其头部与颈部，使食道伸直。将喂养针的圆头沿口腔顶部向咽后部右侧推进，然后轻柔地进入食道，并注入100 μl溶液。操作过程中不应感到任何阻力。
4. 链霉素处理后20小时，再次停止供水和食物，然后使小鼠感染细菌。
5. 通过口服灌胃法给予每只小鼠100 μl HBSS中的菌液悬液，或给予无菌HBSS（对照组）。灌胃操作步骤同2.3）中链霉素灌胃方法。

动物实验采用6-7周龄的无特定病原体雌性C57BL/6小鼠（Taconic，纽约州哈德逊）进行，实验方法如前所述¹。该实验方案经罗切斯特大学动物资源委员会（UCAR）批准。

3. 检测 沙门氏菌 在肠道中

1. 收集小鼠粪便（约 100 mg）。
2. 将粪便样本转移至含有 1 ml PBS 的 1.5 ml 微型离心管中，并剧烈涡旋振荡。
3. 以 800 rpm 离心 10 分钟，将上清液转移至新的洁净微量离心管中。
4. 以 6000 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液，向沉淀中加入 200 μL PBS 并涡旋振荡。
5. 用一次性细胞涂布器将 200 μl PBS 涂布于 BBL CHROMagar 平板上，以检测 Salmonella。Salmonella 菌落呈紫红色（从粉红至紫色，见图1）。若 200 μl 样本导致平板上菌落过多，可改用 100 μl 或 50 μl 进行涂布。

4. 代表性结果。

当实验方案正确执行时， 鼠伤寒沙门氏菌 可在小鼠肠道内检测到定植持续超过6个月。 沙门氏菌 可在感染后6个月通过粪便培养检测到（图1）。该模型的典型结果是，感染后4周内出现体重下降和死亡。取决于 沙门氏菌 用于感染的菌株，部分小鼠可能无法存活超过6个月。

图1. 肠道 沙门氏菌 在 沙门氏菌 菌落呈紫红色（从玫瑰色至紫色），这是由于在特定显色剂存在下其代谢差异所致。其他细菌则被抑制，或形成蓝绿色或无色菌落。

图2. 感染 Salmonella 突变株 PhoP^c、PhoP^c AvrA- 和 PhoP^c AvrA-/AvrA+、PhoP^c AvrA 的小鼠在4周（28天）内的生存比例。

表1. 感染小鼠的体重 沙门氏菌 4 周。

	0	1 周	2 周	3 周	4 周
对照	16.78 ± 1.05	16.91 ± 1.28	18.26 ± 1.23	19.31 ± 1.26	20.26 ± 1.15
PhoPc	16.89 ± 1.03	17.14 ± 1.19	17.43 ± 1.63*	18.68 ± 1.78	20.05 ± 1.11
PhoPcAvrA-	16.91 ± 1.12	16.96 ± 1.39	17.06 ± 2.14**	18.71 ± 2.18	20.15 ± 1.56
PhoPc AvrA-/AvrA+	16.94 ± 0.96	17.17 ± 1.02	17.63 ± 1.42*	18.44 ± 2.03	20.09 ± 1.17

*与对照组相比，p<0.05
**与对照组相比，p<0.01

表2. 本研究中使用的Salmonella菌株。

名称	描述	参考文献或来源
Salmonella 14028s	野生型 S. typhimurium	ATCC
PhoPc	非致病性复合调控因子突变株	Miller et al., 1990
PhoPc AvrA-	AvrA- 突变	Collier-Hyams et al., 2002
PhoPcAvrA-/AvrA+	携带编码 AvrA 的互补质粒的 PhoPcAvrA- 菌株	Collier-Hyams et al., 2002

讨论

使用该系统需要研究人员掌握对动物进行灌胃的技术。我们详细介绍了一种制备细菌培养物并对小鼠进行灌胃的方法。我们还展示了如何监测沙门氏菌（Salmonella）在胃肠道（GI）中的持续存在情况。本方案中的关键步骤包括：

1. 链霉素预处理：链霉素预处理可清除部分共生肠道菌群，使小鼠易于感染Salmonella²。
2. Salmonella 灌胃：对初学者而言，灌胃操作可能具有挑战性。有时灌胃失败，原因是溶液误注入气道，导致小鼠死亡。
3. 持续性细菌定植：需密切监测胃肠道内的细菌。除小鼠粪便培养外，盲肠内容物也可用于BBL CHROMagar平板上的Salmonella检测。在Salmonella感染后处死小鼠时收集盲肠内容物。

我们已在不同浓度下检测了Salmonella在小鼠体内的定植情况：1 × 10³ 至 1 × 10⁸ 菌落形成单位（100...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
LB肉汤	BD Biosciences	244610
喂养针	Popper & Sons, Inc.	7920
链霉素	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
一次性细胞涂布棒	Biologix Research Company	65-1010