活细胞成像与胚胎上皮细胞的定量分析 Xenopus laevis

摘要

Xenopus 胚胎上皮是研究细胞行为（如上皮形态发生过程中极性建立和细胞形态变化）的理想模型系统。传统的固定样品组织学方法正越来越多地被活细胞共聚焦成像所补充。本文中，我们演示了分离青蛙组织的方法，并利用活细胞共聚焦显微镜观察活体上皮细胞及其细胞骨架的实验技术。

摘要

胚胎上皮细胞是研究形态发生过程的理想模型，其中多细胞组织会发生几何形状的改变，例如细胞表面积和细胞高度的变化，同时细胞还会进行有丝分裂并发生迁移。此外，上皮细胞还能调控邻近组织的形态发生运动。¹. 研究上皮细胞和组织的一种传统方法是利用化学固定和组织学方法来确定细胞形态或特定目的蛋白的定位。这些方法至今仍然有用，能够提供细胞形状和组织结构的“快照”；然而，关于细胞如何获得特定形态、各种蛋白如何移动或定位于特定位置，以及细胞走向最终分化命运所遵循的路径，仍有许多问题有待阐明。高分辨率活体成像技术可补充传统方法，并能更直接地探究多细胞上皮层在形成、维持及形态发生过程中所涉及的动态细胞活动。本文中，我们演示了从动物帽组织分离开始的实验方法Xenopus laevis胚胎到上皮细胞的共聚焦成像以及简单的测量方法，这些技术共同促进了上皮形态发生过程中分子与细胞水平研究的深化。

方案

开始之前

1. 从编码荧光标记蛋白的线性化DNA模板合成加帽mRNA，并通过标准方法纯化mRNA（AmpliCap Transcription kit；Epicentre Biotechnologies，Madison WI）。mRNA应分装至0.2 ml离心管中，每管仅供单次使用，并储存于-80℃80°C.
2. 获取卵子的标准方法， 体外 受精及卵膜去除的方法此前已有描述²获取卵子的操作步骤 Xenopus laevis 雌性青蛙更早被证实³. 给卵子受精 体外 从雌性青蛙获取卵子后，立即使用先前从雄性青蛙分离的睾丸进行受精。受精后20分钟去除卵子的胶状层，并立即注射mRNA、蛋白质、DNA或葡聚糖，以确保显微注射试剂充分扩散。受精1小时后进行的注射通常无法使试剂从注射位点有效扩散。
3. 卵母细胞显微注射此前已有报道⁴ 使用压力阀控制的注射器（PLI-100，Harvard Apparatus）进行注射。采用类似方法在1至4细胞期的非洲爪蟾胚胎动物极半球注射mRNA。将受精胚胎转移至含3% Ficoll（Sigma，St. Louis MO）的1× MBS溶液（MBS-Ficoll）中，并显微注射所需体积（2至4 nl）的带有帽结构的mRNA，该mRNA编码定位于细胞膜的GFP（mem-GFP）或F-肌动蛋白结合的GFP（moe-GFP）。为获得均匀分布，应在动物极等间距的4个位点进行注射。胚胎可在MBS-Ficoll中保存数小时，但在原肠胚形成开始前需转移至1/3× MBS溶液中。

所需材料（标有 * 的物品见图1）：

1. 配备光纤照明的解剖体视显微镜。建议使用冷却的解剖载物台，但非必需。
2. 毛发制工具（毛发刀和毛发环）*。
3. 镊子（Dumont #5 不锈钢镊子；Fine Science Tools，Foster City，CA）*。
4. 改良 Barth 盐溶液胚胎培养基（MBS；88 mM NaCl，2.4 mM NaHCO₃，1 mM KCl，0.33 mM CaCl₂，0.41 mM (CaNO₃)₂，0.82 mM MgSO₄，10 mM HEPES（H3375，Sigma-Aldrich，St. Louis MO））。
5. 用于 Amy 外植体培养的 Danilchik 培养基（DFA；53 mM NaCl₂，5 mM Na₂CO₃，4.5 mM 葡糖酸钾，32 mM 葡糖酸钠，1 mM CaCl₂，1 mM MgSO₄）。DFA 中需添加 0.1% 牛血清白蛋白（BSA；A7906，Sigma-Aldrich）。DFA 必须经过无菌过滤，但可分装至 50 ml 锥形管中，于 -20°C 保存。应向新解冻的 DFA 中加入抗生素和抗真菌剂（终浓度 0.8%；A5955，Sigma-Aldrich），以抑制细菌或真菌生长。
6. 60 或 100 mm 培养皿*。
7. 大号盖玻片，45 × 50 mm（12-544-F，#1.5；Fisher Scientific，Hampton，NH）*。
8. 小号盖玻片，24 × 40 mm（12-544C，#1.5；Fisher Scientific）。
9. 装入注射器“ caulking-gun”中的硅脂（High Vacuum，Dow Chemical）*。
10. 定制丙烯酸培养室或尼龙垫圈（Small Parts Inc.；Miramar，FL）*。定制培养室可在机加工车间使用 25 × 50 × 5 mm 的丙烯酸块加工而成，内腔尺寸为 1.2 cm × 2.8 cm，工作体积为 1.68 ml。可选不同规格的尼龙垫圈；我们倾向于选择与直径 18 mm 的圆形玻璃盖玻片匹配的规格。
11. 金刚石划线笔*。

第1部分：动物帽外植体的切除

1. 在1/3 × MBS中将胚胎培养至所需发育阶段⁵。通过调节培养温度在15至21°C之间可控制胚胎发育速度，以便在合适的时间进行实验。也可使用室温培养，但胚胎发育会更快。
2. 将胚胎转移至DFA中。
3. 使用镊子去除卵黄膜。
4. 在解剖体视显微镜下，使用毛刀和毛环切取动物极帽外植体⁶。用毛环固定或支撑胚胎至适当位置，用毛刀在胚胎的动物极进行小切口。通过毛刀反复“ flick-cut”操作完成360°环形切割，从而将动物极帽外胚层从胚胎上分离。经过练习后，可实现平滑切割，使外植体损伤最小化，并减少边缘细胞裂解（图2A）。
5. 重复步骤4，切取3至4个动物极帽外植体，并进入第2部分。切割外植体时操作必须迅速，因其容易迅速回缩成球状。使用冷却的解剖台可减缓此过程，或者可减少外植体的制备数量。

第二部分：准备培养室、接种外植体并密封培养室以进行长期培养

1. 使用硅脂将亚克力培养室粘合或密封到底部的大盖玻片上。
2. 为减少外植体与玻璃表面的黏附，可在室温下孵育2至4小时，或在4°C过夜，用含1% BSA的1/3× MBS（BSA-MBS）溶液覆盖培养室内的玻璃表面，以包被非黏附性基质。
3. 使用金刚石笔制备小片盖玻片碎片（约2 × 8 mm），并预先用BSA-MBS溶液进行包被处理。
4. 用DFA培养基冲洗掉培养室中的BSA-MBS溶液，并更换为DFA培养基。
5. 切取动物极帽外植体（第1部分；图2A），转移至培养室中。使用毛发环将每个外植体放置到位（上皮层朝向培养室底部），并用少量高真空脂固定的小盖玻片碎片轻轻压住外植体以固定其位置（图2B）。按压盖玻片时需格外小心，因压力过大易压碎外植体。根据用于固定的盖玻片碎片大小，每个培养室可装载多个外植体。熟练操作后，本实验所述的亚克力培养室最多可装载20个外植体。向培养室中加入DFA培养基，直至液面与顶部开口齐平。使用硅脂将24 × 40 mm的盖玻片密封于培养室顶部。通过添加或移除DFA培养基以减少密封腔室内的气泡，并用吸水纸吸去溢出的液体。
6. 此密封培养室可通过底部大面积玻璃表面实现动物极帽外植体的长期培养与活体成像。为便于后续成像，必须保持培养室底部玻璃表面洁净，无灰尘、油脂或培养基残留。建议准备底部铺有纸巾的培养皿，用于存放待成像的培养室。

第3部分：高分辨率活体成像共聚焦显微镜

本节所述方案已针对我们实验室配备的共聚焦显微镜（Leica TCS SP5；Leica Microsystems，Bannockburn IL）进行优化。不同型号的共聚焦显微镜可能需要稍作调整，建议用户遵循各自仪器的操作说明。

1. 启动成像系统，初始化显微镜载物台，并打开适用于荧光染料的激光器，例如用于荧光素或EGFP的氩离子激光器，以及用于罗丹明或RFP的543 HeNe激光器。
2. 将装有外植体的培养腔室放置到显微镜载物台上。在定位腔室之前，先将合适的物镜移至工作位置。我们建议在初始成像时使用高数值孔径的20倍干式物镜（0.7 n.a.）；对于高分辨率成像及大范围细胞区域的追踪，建议使用1.4 n.a.的40倍或63倍油镜。（注意：一旦在物镜上滴加浸油，在使用干式物镜时需格外小心，避免无意中将干式物镜浸入油中。）使用小重物固定腔室位置。
3. 使用明场或荧光照明，并调节焦距，直至观察到表层细胞的顶端末端。注意不要让物镜“撞击”到腔室底部。使用油浸物镜时，应避免引入或产生气泡。当使用“粗调”模式完成样本定位后，切换至“微调”模式。
4. 活体成像时共聚焦参数调节建议：
   1. 激光功率应尽可能保持最低：1）防止荧光漂白，2）避免光毒性效应，3）防止意外触发细胞形态变化⁷。激光功率需求取决于胚胎中表达的分子探针类型及其表达水平。
   2. 活体成像建议采用1024 × 1024像素的扫描格式，以获得良好的图像分辨率。若需要非常高的帧率（本系统最低为1.3秒），可使用512 × 512像素的扫描格式。这会降低图像分辨率，但仍足以提取足够信息。
   3. 根据需要适当调节发射、二向色镜和激发滤光片的光谱范围。
   4. 将共聚焦针孔调节至1至1.5艾里单位之间。
   5. 光电倍增管增益应保持在最低水平，以减少噪声，同时提供足够的信号用于识别细胞结构和蛋白定位。
   6. 调节黑电平偏移，以优化背景，提升图像质量。
   7. 重复执行步骤（1）至（6），迭代优化，以获得尽可能高质量的图像。高质量图像应能清晰分辨结构或定位蛋白，且像素强度具有较宽的动态范围。若目标为定量分析，则应尽量减少零强度或饱和像素的数量。
   8. 对于每个额外的荧光通道，均需重复步骤（1）、（3）、（5）和（6），以获得尽可能最佳的图像质量。
   9. 在同时成像两种或多种荧光探针时，需确保一种蛋白的信号对另一种蛋白发射光谱的光谱串扰最小。可通过降低激发第一种蛋白的激光功率，并观察第二种蛋白所用波长范围内的信号来检测串扰。可通过选择更严格的滤光片，或降低激发激光功率并提高第一种蛋白检测时的增益，来减少光谱串扰。
5. 按照上述指南调节共聚焦系统后，即可在X-Y模式下采集单个焦平面的单幅图像（图3A）。
6. 若需对动态过程（如细胞收缩过程中的形态变化⁷）进行延时成像，可从以下共聚焦模式中选择：
   1. X-Y-T模式：该模式允许在不改变Z平面的情况下，随时间采集一系列图像。我们使用此模式观察上皮细胞的自发波动。通常，每5秒采集一帧，持续20分钟，以观察自发变化或外界刺激诱导的形态改变。帧率的选择完全取决于观察目标及过程的动态程度。
   2. X-Y-Z模式：使用该模式，可对上皮细胞进行单次Z轴层扫成像。我们默认的Z轴扫描设置为在5 μm范围内以0.1 μm步进采集。该模式用于判断细胞骨架变化是否仅发生在特定位置（如黏附连接水平），或在整个细胞皮层中均发生。
   3. X-Z-T模式（图3A'）：该模式主要用于观察上皮细胞顶-基底极性组织的快速变化。该模式因其可验证X-Y-T模式是否可靠反映顶区细胞域的变化，以及共聚焦图像采集是否在Z轴方向发生漂移而广受欢迎。
   4. X-Y-Z-T模式：该模式结合了X-Y-Z和X-Y-T模式。可提供上皮组织完整顶-基底动态的丰富细节，但采集完整的图像堆栈速度较慢，且可能因光漂白和光毒性效应显著降低细胞活力。
7. 可通过以下四种方法中的一种或多种组合，在一定程度上提升图像质量：1）线平均，2）线累积，3）帧平均，4）帧累积。这些图像采集平均模式可改善图像质量，但会降低细胞活力，并延长图像采集时间。
8. 在所有参数仔细调节完成后，将图像、Z轴序列和时间序列数据保存至外接硬盘、U盘或网络存储服务器。
9. 实验完成后，为安全起见，先降低物镜位置，再用镜头纸清洁物镜和显微镜载物台上的浸油，最后关闭共聚焦系统电源。

第4部分：F-肌动蛋白微丝的活体成像

如第3部分所示，膜定位蛋白mem-GFP可用于荧光标记细胞膜。通过使用其他蛋白质可实现亚细胞结构的活体成像。例如，含有F-肌动蛋白结合结构域的蛋白moesin-GFP可用于在活细胞中标记F-肌动蛋白。活细胞成像及时间序列图像采集的类似策略遵循第3部分所述的操作流程。由于F-肌动蛋白结构比细胞膜更精细且定位更紧密，因此对F-肌动蛋白的活体成像相比mem-GFP成像需要更高的显微镜操作技能。例如，浸油中任何微小气泡都可能产生像差伪影，如图像模糊或亮度不均。此外，焦平面或Z轴方向上任何微小的漂移都可能导致moesin-GFP标记的皮层F-肌动蛋白失焦。因此，在对皮层F-肌动蛋白及其他亚细胞蛋白进行成像时，应加倍努力确保载物台、外植体和成像腔的稳定性。图3B和B'展示了moesin-GFP标记F-肌动蛋白的X-Y和X-Z-T成像示例。

第5部分：图像分析

可通过分析活细胞共聚焦实验获得的图像和延时序列，以验证有关细胞形态变化或蛋白质定位模式的假设。肉眼通常是进行定性分析的最佳工具，但也可借助图像分析技术来提取定量数据，从而增强或实现分析的自动化。徕卡共聚焦系统获取的图像数据可保存为开放格式（如 .TIF 格式图像文件）或保留采集过程中显微镜详细参数的专有 .LIF 格式。.TIF 和 .LIF 文件均可通过免费图像分析软件 Image J（Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2009）结合 Bio-Formats 插件（Kevin Eliceiri, LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI）直接导入。在下文中，我们提供两个示例，说明用户如何开始对共聚焦图像数据进行定量分析。

1. 使用“文件 > 打开”打开任意 .TIF 或 .LIF 文件（图4 A 和 A'）。
2. 示例 1：测量上皮细胞的细胞面积（图 4B 至 B'''）。
   1. 在“分析 > 设置测量”中选择“面积”。
   2. 从 Image J 工具栏中选择多边形选择工具，并勾勒出细胞轮廓。
   3. 从“分析 > 工具 > ROI 管理器”打开 ROI 管理器，然后按 [control-t] 将轮廓添加至其中，该快捷键用于将任何新的“感兴趣区域”（ROI）添加到 ROI 管理器。添加此选择并保存 ROI 集非常重要，因为您可以在以后随时返回并进行其他参数的测量。保存的 ROI 集（点击“保存”）可于后续重新加载以进行进一步分析。
   4. 可在一幅图像中对任意数量的细胞重复步骤 (c)，并将这些 ROI 添加至 ROI 管理器。当记录了足够数量的 ROI 后，在 ROI 管理器中点击“测量”。在“结果”窗口中，现在可以看到各 ROI 对应的面积值。图像尺寸在测量参数中具有相应的数值。
3. 示例 2：测量细胞膜的强度（图 4C 至 C'''）。
   1. 从 Image J 工具栏中选择“直线”工具，在图像上绘制一条垂直于目标细胞膜并穿过该膜的直线。这种直线选择是另一种类型的 ROI，可如上所述添加至 ROI 管理器。
   2. 通过“分析 > 轮廓分析”绘制相对强度（单位为任意单位）。在“图表”窗口中，分别点击“保存”和“列表 > 文件 > 另存为”，将图表保存为图像和数值列表。
4. 可根据研究人员的兴趣和所检验的假设，使用 Image J 进行多种定量测量。可使用 Microsoft Excel（Microsoft Corporation, Seattle, WA）或 Sigma Plot（Systat Software Inc., San Jose, CA）进行数据的图形化绘图。此前已有研究报道过更多图像分析的应用实例⁷。

图1. 所需材料。A) 显微手术和培养室组装所需的工具。培养皿（a）、大号盖玻片（b）、毛发操作工具（c）、金刚石笔（d）、镊子（e）、硅脂“ caulking gun”（f）、尼龙垫圈（g）以及定制丙烯酸培养室（h）。B) 毛发刀的特写，以及 C) 毛发环。

图 2. 动物帽外植体的切除。A) 显微外科操作示意图，用于移除动物帽外植体（d，背侧；v，腹侧；ah，动物极半球；vh，植物极半球）。B) 外植体（e）置于由硅脂（s）固定的盖玻片碎片下方，其顶面紧贴BSA包被的玻璃（g）。外植体放置方向使其上皮层最接近显微镜物镜（m）。C) 动物帽外植体（红色箭头）在DFA中培养，置于丙烯酸培养室（蓝色箭头）内，该培养室位于大片玻璃盖玻片（黑色箭头）上，并由盖玻片碎片和硅脂固定。

图 3. 使用共聚焦显微镜观察的上皮细胞。A) 膜定位 GFP（mem-GFP）标记的上皮层的 X-Y 视图和 X-Z（A'）视图。B) moesin-GFP 标记的 F-肌动蛋白顶端细胞皮层的 X-Y 视图和 X-Z（B'）视图。

图4. 使用Image J进行图像分析。A) 定位于膜的GFP标记细胞层的原始图像。高分辨率视图（A'）显示了（A）中框选区域的放大细节，包含两个“感兴趣区域”（ROIs）。黄色轮廓表示使用多边形工具选定的单个细胞边界（见B图），绿色线条表示使用直线工具选定的跨细胞-细胞边界的强度剖面路径（见C图）。B') 选择测量选项并勾选“面积”（Area）的方法（B''）。选定ROI后，可将其保存至ROI管理器（B'''）。C') 选择剖面测量选项的方法。C'') 选定直线或分段线工具后，可通过“绘制剖面”（Plot profile）命令绘制沿路径的强度分布图，同时可将强度值列表以电子表格可读格式保存。

讨论

我们介绍了在实验室中常规使用的实验方案，用于对非洲爪蟾（Xenopus）胚胎上皮细胞的顶端细胞皮层中动态变化的细胞骨架以及振荡的细胞膜进行成像。这些方案可作为活体成像上皮细胞形态的起点；优化本方案至关重要，部分设置将根据所使用的显微镜系统类型以及拟成像蛋白的种类而有所调整。该方案的各个步骤（包括外植体分离、细胞及亚细胞结构的成像与可视化，以及定量分析方法）共同构成了一套系统完整的研究上皮细胞形态发生的方法流程。

需要牢记的关键要点

1. 制备高质量的 mRNA 用于胚胎显微注射非常重要。mRNA 管应置于冰上保存，以避免降解。检测完成后，应将 mRNA 分装成小份并储存在 -80°C，以避免多次冻融循环。
2. 必须将 mRNA 注射到多个位点，以确保在动物帽外胚层的大片细胞区域内实现 mRNA 的均匀分布。
3. 长期培养过程中必须添加抗生素/抗真菌剂，以抑制细菌和真菌的生长。
4. 在用盖玻片碎片压紧外植体时需格外小心，因为过大的压力会压碎外植体。
5. 成像时，优化的成像参数至关重要，以在最佳...