本视频展示了从白蚁后肠中栖居的微生物物种提取DNA的技术。同时演示了湿封片的制备方法，该方法有助于观察肠道微生物群落，并带领观众了解这一物种丰富的肠道环境。
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摘要
摘要
白蚁是已知少数能够仅以木材为食而生存的动物之一。白蚁肠道内含有密集且物种丰富的微生物群落，这些微生物主要将木质纤维素降解为乙酸，而乙酸是驱动白蚁新陈代谢的关键营养物质（Odelson & Breznak, 1983）。这些微生物群落包括细菌、产甲烷古菌，以及在某些“低等”白蚁中存在的真核原生生物。因此，白蚁是研究微生物物种之间相互作用及其为宿主执行多种生物化学功能的理想研究对象。研究人员已采用分子技术探索了白蚁肠道微生物群落的物种组成以及参与各种生物化学过程的关键基因（Kudo et al., 1998；Schmit-Wagner et al., 2003；Salmassi & Leadbetter, 2003）。这些技术依赖于从白蚁肠道环境中提取和纯化高质量的核酸。本视频所介绍的提取方法是对多种针对环境样品核酸提取与纯化方案（Mor et al., 1994；Berthelet et al., 1996；Purdy et al., 1996；Salmassi & Leadbetter, 2003；Ottesen et al., 2006）进行改良后整合而成，可从白蚁后肠材料中提取适用于聚合酶链式反应（PCR）模板的DNA。
方案
白蚁完整肠道DNA提取的操作摘要：
- 将白蚁置于冰上冷却，用无菌镊子取出肠道，并将肠道样本置于缓冲液中稳定保存。
- 在含PVPP/SDS/苯酚的缓冲液中匀浆处理样本。
- 使用Qiagen DNeasy柱从粗裂解液中提取并纯化DNA。
实验方案：
- 在冰上使用无菌镊子从工蚁白蚁中取出肠道。
- 立即将肠道及其内容物转移至含有 50 μL 冰冷的 1x 分子生物学级 TE 缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0）的无菌、无核酸酶试管中。 将样品在 -20°C 冻存，或直接进行匀浆处理。
- 将肠道样品和缓冲液转移至预先装有 500 mg 无菌氧化锆/二氧化硅珠（0.1 mm）和 700 μL 含 1% w/v 聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）的 1x TE 缓冲液的无菌、无核酸酶 2 ml 螺口管中。
- 向样品中加入 50 μL 20% 十二烷基硫酸钠（SDS）和 500 μL 苯酚。
- 使用最高档位进行匀浆（珠磨），共进行三个循环，每个循环包括 30 秒匀浆和 30 秒冰上冷却。
- 在 8,000x g 条件下离心 1 分钟，沉淀不溶性物质。
- 使用 Qiagen DNeasy 柱，按照粗裂解液纯化方法所述，对 300-μl 的水相（最上层）进行纯化。
- 定量核酸含量，并将样品在 -20°C 冻存以备后续使用。
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讨论
根据我们的经验，从类似内华达木白蚁（Zootermopis nevadensis）等食木白蚁物种的微生物群落中提取的DNA，经过一轮提取和纯化后，其纯度已足以作为PCR模板。然而，某些白蚁，如食腐屑或食土白蚁物种，其肠道内容物中腐殖酸浓度可能较高，可能需要对肠道微生物DNA进行额外的纯化步骤。5只Z. nevadensis工蚁肠道提取的总DNA产量约为10–30 μg。对于体型显著小于或大于该物种的白蚁，可能需要更多或更少的个体才能获得相当量的DNA。
该方法可轻松调整用于RNA提取。进行RNA提取时，用Qiagen的1× RNAprotect细菌试剂（目录号76506）替代方案第2步中所述的冰冻TE缓冲液。应使用Qiagen RNeasy试剂和柱子（目录号74104）替代上述DNeasy纯化步骤。由于DNA可从经RNAprotect稳定的样品中纯化，且核酸纯化仅需第7步中回收的约700 μL水相层中的300 μL，因此该方法可用于从单个样品中平行提取DNA和RNA。
这些技术依赖于从白蚁肠道环境中提取和纯化高质量的核酸。...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/苯酚 | 缓冲液 | 匀浆缓冲液 | ||
| DNeasy 组织试剂盒 | 试剂盒 | Qiagen | 77607 | 按照基因组DNA从粗裂解液中提取的操作流程使用（附录H，产品说明书版本：2003年7月） |
| TE | 缓冲液 | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x 缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0），由100x浓缩液稀释而成 |
| 氧化锆/二氧化硅珠 | 耗材 | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | 试剂 | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v 聚乙烯多吡咯烷酮，由干粉试剂配制，以TE缓冲液制成1x悬浮液 |
| Zootermopsis nevadensis | 动物 | 白蚁 | ||
| SDS | 试剂 | Sigma-Aldrich | L4390 | 十二烷基硫酸钠，由干粉试剂配制成20%水溶液 |
| 苯酚 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 77607 | 经TE饱和，浓度约73% |
| MiniBeadbeater-8 | 工具 | Biospec Products | 963 | |
| BSS | 缓冲盐溶液，pH 7.2 | 每升配方：2.5 g K2HPO4，1.0 g KH2PO4，1.6 g KCl，1.4 g NaCl，0.075 g CaCl，1 g MgCl，以及10 mL 1 M NaHCO3溶液 | ||
| AxioPlan-2 | 显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | 配备40x物镜、1.6x光学变倍器和10x目镜。样品采用相差照明观察 |
参考文献
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
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