我们建立了脑室周围白质软化症（PVL）的小鼠模型，PVL 是早产儿主要的脑损伤类型，其特征为脑室周围白质损伤。缺氧/缺血伴或不伴全身感染是 PVL 的主要原因。通过单侧颈总动脉结扎联合缺氧暴露，伴或不伴脂多糖注射，可在出生后第6天（P6）小鼠中诱导出类似 PVL 的病变。
本文内容
摘要
摘要
我们描述了一种建立脑室周围白质软化症（PVL）小鼠模型的实验方案。PVL是早产儿脑损伤的主要形式，也是脑性瘫痪最常见的病因。PVL的特征是脑室周围白质损伤，伴有明显的少突胶质细胞损伤。缺氧/缺血，无论是否合并全身性感染/炎症，是导致PVL的主要原因。我们采用出生后第6天（P6）的小鼠，通过单侧颈总动脉结扎后暴露于缺氧环境，同时或不同时注射内毒素脂多糖（LPS），以诱导缺氧/缺血伴或不伴全身感染/炎症，从而建立新生儿脑损伤模型。髓鞘碱性蛋白（MBP）或O1的免疫组织化学染色以及电镜检查显示，大脑白质出现显著的髓鞘丢失，并伴有海马和丘脑的附加性损伤。PVL小鼠模型的建立将极大促进利用现有转基因小鼠品系对疾病发病机制的研究，有助于以相对高通量的方式开展药物筛选以鉴定潜在治疗药物，并可利用免疫缺陷小鼠品系测试干细胞移植治疗效果。
关键词：脑室周围白质软化症，PVL，小鼠模型，缺氧/缺血，脂多糖，LPS，少突胶质细胞，髓鞘，MBP，O1，免疫组织化学，电镜，脑性瘫痪，新生儿脑损伤
方案
在P6小鼠中建立新生儿脑损伤的详细操作步骤：
- 出生后第6天（P6）的小鼠通过在冰上进行间接冷却麻醉，直至对有害刺激无反应（深度麻醉）。
- 用酒精清洁皮肤后，在颈部前侧做正中腹侧切口。
- 在解剖显微镜下，轻轻牵开肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌，暴露右侧颈总动脉的分叉处。
- 去除颈动脉鞘周围的筋膜，用钩子将颈内动脉近端分支与附近的迷走神经和交感神经节分离，随后使用电灼头对颈内动脉进行电灼。
- 电灼后缝合皮肤切口，动物保持温暖直至完全清醒，然后放回母鼠身边。
- 结扎一小时后，将动物置于充满氮气的密闭舱内，直至氧气浓度降至6.0% O2，随后暴露于低氧环境35分钟。
- 低氧暴露后，小鼠在加热垫（33°C）上恢复30分钟，然后放回母鼠身边。若需建立合并低氧/缺血与感染/炎症的脑损伤模型，则在此时经腹腔注射0.015 ml脂多糖（LPS，1 mg/kg）。
- 低氧/缺血处理四天后，小鼠通过在冰上间接冷却麻醉至对有害刺激无反应，随后用生理盐水灌注，再用4%多聚甲醛灌注。取出大脑并进行冷冻保护。
图 1. 采用 H & E 染色对缺氧/缺血小鼠模型中脑损伤的表征。与对侧脑白质（B）相比，同侧脑白质（A）出现局灶性坏死（箭头所示）。在伴有同侧脑白质损伤的脑组织中，海马（C）和丘脑（D）可见同侧坏死及局灶性微梗死。
代表性结果与图示：
通过单侧颈总动脉结扎后暴露于低氧环境并注射LPS，可建立伴有低氧/缺血和/或感染/炎症的PVL小鼠模型。我们将这些新建立的小鼠模型定义为合适的PVL模型。对整个前脑进行冠状切片并用苏木精-伊红（H & E）染色后进行神经病理学检查，结果显示在结扎侧大脑半球的中央白质区域出现局灶性坏死（图1A），与对侧脑白质相比，覆盖其上的大脑皮层神经元相对保留（图1B）。在局灶性坏死的白质区域，细胞密度显著增加，主要由巨噬细胞和反应性星形胶质细胞构成，这与人类局灶性PVL的特征一致。在对侧中央白质中，少突胶质细胞核呈束状排列；而同侧的局灶性坏死则完全破坏了这种结构。值得注意的是，在伴有同侧脑白质损伤的脑组织中，我们还观察到海马区的同侧坏死（图1C）以及丘脑区的局灶性微梗死（图1D）。人类PVL通常也不会孤立发生，常伴随灰质病变。PVL的典型特征是受损白质上方的大脑皮层神经元出现相对（尽管并非完全）保留，我们认为这一特征在我们的小鼠模型中同样存在。
图2. 采用MBP或O1对小鼠模型中脑室周围白质软化症的白质损伤进行评估的0-5分评分标准。
我们的小鼠模型在表型和分子水平上均表现出脑室周围白质软化（PVL）的特征。我们采用髓鞘碱性蛋白（MBP）或O1抗原的免疫细胞化学检测来评估损伤程度，建立了从0到5的标准评分量表以对白质损伤进行评分（图2），并系统描述了白质的病理变化（图3）。近期，我们引入了一种无偏倚的体视学检测方法，以替代最初的半定量分析。此外，为了检验白质损伤对功能结局的相关影响，我们开展了运动功能的行为学测试。我们已证实，在出生后第6天接受缺氧/缺血联合脂多糖（LPS）处理的小鼠，在出生后第10至21天表现出显著的运动功能障碍。我们建立了评分标准，采用0-4分的量表来定义损伤小鼠在出生后第10至21天对侧肢体功能障碍的程度。通常情况下，正常小鼠能够迅速爬上30°斜坡（得分为4分），并能在不滑动的情况下爬上45°斜坡（得分为3分）。损伤小鼠的得分较低，且与白质损伤的程度呈相关性。
图3. 通过MBP或O1染色以及电子显微镜（EM）观察髓鞘结构，对白质损伤进行表征。与结扎对侧的白质相比，MBP和O1染色显示结扎同侧大脑白质存在髓鞘丢失。电子显微镜检查显示，结扎对侧大脑白质中存在有髓轴突，而同侧白质组织则出现退变。
我们预期，建立新的PVL小鼠模型将使我们能够研究类似PVL的损伤对未成熟大脑的特定作用机制。我们将利用转基因小鼠品系探讨特定目标分子的作用，并评估神经保护的潜在靶点，从而阐明其发病机制。
讨论
发育中的大脑受损会导致严重的神经系统后果。引人注目的是，围产期脑损伤的模式具有显著的年龄依赖性。在足月婴儿中，损伤主要累及大脑皮层，并伴有特征性的神经元丢失。然而，在早产儿中，损伤则选择性地影响大脑白质，导致发育中的少突胶质细胞显著受损，这种疾病被称为脑室周围白质软化（periventricular leukomalacia, PVL）。早产儿脑损伤问题的严重程度极为突出。由于早产以及新生儿重症监护技术的进步，全球每年出生的约1300万名出生体重低于1500克（即极低出生体重儿）的早产儿中（美国约5.6万名），存活率接近90%。然而，约10%的存活者随后会出现脑性瘫痪，约50%存在认知和行为障碍。PVL是早产儿发生脑性瘫痪最重要的脑部病理基础。目前尚无针对PVL的特异性治疗，部分原因在于其发病机制尚未被充分阐明1,2。
尽管PVL的病因是多因素的，但围产期缺氧/缺血合并母体宫内感染被认为是PVL的主要病因。既往已在出生后第7天（P7）的大鼠中建立了PVL的缺氧/缺血模型3。该模型的独特之处在于其与早产儿PVL相似。此模型的特征是选择性白质病变，这与大多数以灰质梗死为特征的脑卒中模型形成对比。然而，不应忽视大鼠缺氧-缺血模型的局限性。首先，PVL的病因常为多因素所致。除缺氧/缺血外，母-胎感染/炎症也与PVL密切相关。因此，联合缺氧/缺血与感染/炎症可能更接近PVL的病理情况。在啮齿类动物中，与人类PVL病变最高风险发育期（妊娠24-32周）最相符的年龄段为出生后阶段，因为少突胶质细胞的分化在啮齿类动物中主要是一个出生后事件。由于无法在出生后阶段建立母-胎感染/炎症，因此在相应的出生后发育阶段模拟感染以建立PVL的啮齿类动物模型是合理的。我们已尝试在出生后第6天（P6）的小鼠中将LPS注射与缺氧/缺血模型相结合，以产生更具临床相关性的PVL病变。其次，验证某个分子在疾病中因果作用的最佳概念验证实验方法需要使用转基因小鼠；而大鼠的遗传操作远比小鼠困难。因此，我们致力于将PVL的实验模型从大鼠转换至小鼠。
脑室周围白质软化症（PVL）的小鼠模型将极大促进以下研究：1）利用现有的转基因小鼠品系研究疾病生物学和发病机制；2）开展药物试验以发现具有治疗潜力的候选药物；3）利用免疫缺陷小鼠品系测试干细胞的应用价值。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（RO1 NS059043 和 RO1 ES015988）、国家多发性硬化症协会、罗氏贫血研究基金会、菲尔德斯坦医学基金会以及儿童神殿医院的资助。
我们感谢 David Pleasure 博士提出的建议。本工作部分由美国国立卫生研究院（RO1 NS059043 和 RO1 ES015988）、美国国家多发性硬化症协会以及儿童神助会医院向 W.D. 提供的资助支持。我们声明不存在与本文相关的利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| 缺氧室 | BioSpherix | A-30274 | |
| 手术钩 | F.S.T. | 10064-14 |
参考文献
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D. Progress in periventricular leukomalacia. Arch. Neurol. 65, 1291-1295 (2008).
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
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