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方法文章

阿尔茨海默病致病因子淀粉样β蛋白的适配体筛选

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DOI：

10.3791/1955

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2010年5月13日

 , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

适配体是通过筛选获得的短链核糖/脱氧核糖寡核苷酸 体外 基于对特定靶标的亲和力的进化方法。适配体是一类具有广泛应用的分子识别工具，可用于治疗、诊断及科研领域。本文演示针对阿尔茨海默病致病因子——β-淀粉样蛋白——的适配体筛选方法。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性、与年龄相关的神经退行性疾病，病程隐匿，导致其症状前诊断十分困难1。确诊AD只能在死后完成，因此建立症状前的早期诊断对于开发和实施有效的治疗方案至关重要2,3。

β-淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中起核心作用。可溶性寡聚态Aβ聚集体被认为参与介导神经毒性，导致AD中突触功能障碍和神经元丢失4,5已描述了多种形式的可溶性Aβ聚集体，然而，它们之间的相互关系及其在阿尔茨海默病病因学和发病机制中的作用复杂，尚不明确。6特定的分子识别工具可能揭示Aβ聚集体之间的相互关系，并有助于在疾病症状出现之前早期检测和表征这些聚集体。分子识别通常依赖于抗体。然而，另一类分子识别工具——适配体（aptamers），相较于抗体具有重要优势7,8. 适配体是由寡核苷酸通过 体外 筛选：指数富集配体系统进化（SELEX）9,10SELEX 是一个迭代过程，类似于达尔文进化，可实现特定性质的选择、扩增、富集和延续，例如高亲和力、特异性的配体结合（适体）或催化活性（核酶和脱氧核酶）。

尽管适体（aptamers）已逐渐成为现代生物技术和医学中的重要工具11，但其在淀粉样蛋白研究领域中的应用仍显不足。目前仅有少数RNA或单链DNA适体被筛选出来靶向不同形式的朊病毒蛋白（PrP）12-16。一项针对重组牛PrP生成的RNA适体被证实可识别牛PrP-β17，即全长PrP的一种可溶性、寡聚态、富含β-折叠的构象变体，该变体能够形成淀粉样纤维18。使用单体及多种形式的纤维状β2-微球蛋白（β2m）筛选获得的适体，也被发现除了结合β2m纤维外，还能结合某些其他淀粉样蛋白的纤维结构19。Ylera et al. 报道了针对固定化单体Aβ40筛选获得的RNA适体20，出乎意料的是，这些适体主要结合纤维态Aβ40。总体而言，这些数据引出了若干重要问题：为何针对单体蛋白筛选的适体能够识别其多聚体形式？是否可以获得靶向淀粉样蛋白单体和/或寡聚体形式的适体？为回答这些问题，我们尝试针对通过未修饰蛋白光诱导交联技术（PICUP）生成的共价稳定化寡聚态Aβ4021进行适体筛选22,23。与先前研究结果类似17,19,20，这些适体可与Aβ纤维以及多种其他淀粉样蛋白的纤维发生反应，很可能识别了一种潜在共有的淀粉样结构表位（aptatope）21。本文中，我们展示了用于生产这些适体的SELEX技术方法21。

方案

第1部分：蛋白质制备与交联

最初，用于SELEX的蛋白质需用1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）进行预处理，以获得均一且无聚集物的样品，具体方法如前所述23。此步骤是必要的，因为预先形成的聚集物会诱导淀粉样蛋白快速聚集，导致实验重复性差24，并且不利于针对未聚集、非纤维化形式的蛋白质筛选适配体。

  1. 使用微量天平称取约 800 μg（约 180 nmol）纯 Aβ40。将干燥的冻干肽转移至已标记的、硅化处理的低吸附性 1.6 ml 微量离心管中。
  2. 按照先前所述方法23，用 100% 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP，400 μl）溶解肽，得到 0.5 mM 的肽溶液。
  3. 将该溶液分成四份，每份 100 μl，使每个管中名义上含有约 45 nmol Aβ40。随后按照先前所述方法23去除 HFIP。
  4. 在将经 HFIP 处理的肽溶于缓冲液以进行交联反应之前，配制交联和终止反应试剂。称取过硫酸铵（APS，分子量 228.2 g/mol），用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）配制成 40 mM 溶液。使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。
  5. 用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）配制 2 mM 的三（2,2'-联吡啶）二氯化钌(II)六水合物（RuBpy，分子量 748.63 g/mol）溶液。使用涡旋振荡器混合并确认完全溶解。用铝箔包裹管子以避光。
  6. 配制终止反应试剂。称取二硫苏糖醇（DTT，分子量 154.5 g/mol），用去离子水或 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）溶解，配制成 1 M 溶液。
  7. 按照先前所述方法23,25精确溶解经 HFIP 处理的肽，但目标获得约 60 μM 的肽溶液。
  8. 按照先前所述方法23进行光引发化学交联（PICUP），以生成寡聚体 Aβ40 混合物。典型的 PICUP 反应在 20 μl 体积中进行，其中蛋白质、RuBpy 和 APS 的终浓度分别为 30 μM、0.05 mM 和 1 mM23。此处用于 PICUP 的混合物包含 108 μl 蛋白质溶液、6 μl RuBpy、6 μl APS 和 1 μl DTT，蛋白质、RuBpy 和 APS 的浓度均为典型反应的两倍。此调整可减少需进行的 PICUP 反应次数，并提高脱盐时的蛋白质浓度。

第2部分：蛋白质样品的脱盐

在将蛋白质用于SELEX之前，需进行脱盐处理以去除PICUP过程中使用的交联试剂。该PICUP反应混合物含有交联试剂以及约55 μM的蛋白质（标称浓度）。

  1. 取下5 ml脱盐柱的顶部盖帽，将柱子固定在支架上，在柱子出口下方放置一个烧杯，并移除出口塞。让保存缓冲液流过柱子并收集到烧杯中。
  2. 用10 mM乙酸铵缓冲液（pH 8.3）平衡柱子。分次加入共3 ml等份、总计5个树脂床体积（25 ml）的该缓冲液至柱中，使其自然流下。
  3. 同时，标记8个低吸附、硅涂层的1.6 ml离心管，并将其放入试管架中。
  4. 柱子平衡完成后，每次单次脱盐使用向柱中加入0.5–0.7 ml的PICUP反应混合物（柱子可经清洗、保存并重新平衡后用于后续实验）。让蛋白混合物渗入柱内树脂，弃去流入烧杯中的穿流液。
  5. 将第一个收集管置于柱子出口下方。向柱中加入0.5 ml乙酸盐缓冲液，并收集最先流出的0.5 ml洗脱组分。
  6. 重复步骤2.4和2.5，依次在相应试管中收集最多八个0.5 ml的洗脱组分。
  7. 另取一组8个低吸附、硅涂层的小型0.6 ml离心管编号后放入试管架中。另标记一个管为“空白”。从每个组分中取出150 μl转移至对应的0.6 ml标记管中。取20 μl用于SDS-PAGE分析（见图1），方法如前所述23。
  8. 向空白管中加入150 μl 10 mM乙酸铵缓冲液（pH 8.3）。此管用于分光光度计测定前调零。
  9. 使用石英比色皿，测定各组分130 μl样品在波长λ=280 nm处的吸光度。
  10. 吸光度测定后，合并蛋白含量最高的组分（通常为第3–5组分），用移液器轻轻混匀，并保留10 μl用于氨基酸分析以确定实际蛋白浓度（图中未显示）。
  11. 将样品分装为每管约含2 nmol蛋白的多份样品，在冻干机中进行冻干处理。
  12. 冻干完成后，按之前方法用100% HFIP处理样品。
  13. 将样品管储存于-20 °C。每个SELEX循环（见下文）使用一管。

第3部分：通过PCR扩增合成的随机单链DNA文库

本研究中用于SELEX的合成单链DNA文库包含49个随机核苷酸（A:T:G:C=25:25:25:25%），其两侧为包含克隆位点（BamHI、EcoRI）和T7启动子的恒定区域，如前所述26。

  1. 为扩增文库，按如下配置标准 PCR 反应体系：202 μl 去离子水，40 μl 10x Taq DNA 聚合酶缓冲液，2 μl ssDNA 模板（0.5 nmol），120 μl 25 mM MgCl2，28 μl 10 mM 脱氧核苷三磷酸混合物（dNTPs），1 μl 正向引物（300 pmol），1 μl 反向引物（300 pmol），以及 4 μl Taq 聚合酶。
  2. 使用热循环仪进行 PCR 反应，程序设置如下：94 °C 预变性 5 分钟，随后进行 20 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、52 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒，最后在 72 °C 延伸 7 分钟。
  3. PCR 反应完成后，按照生产商说明书，使用 Qiagen QiaQuick PCR 纯化试剂盒纯化扩增的 DNA 产物。通常在这些实验中，DNA 的浓度和得率约为 160 ± 10 ng/μl（总体积 50 μl）。
  4. 通过 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 后 DNA 的量。

第4部分：生成 32P标记的RNA通过 体外 转录

  1. 根据制造商说明书，在带有O形圈盖的1.6 ml离心管中设置转录反应，具体步骤如下并作部分修改： 20 μl 5x T7 转录缓冲液, 7.5 μl 各100 mM rATP、rGTP、rUTP 1 μl 100 mM rCTP, 2 μl α32P-CTP（3000 Ci/mmol），5-10 μg 纯化的DNA模板（约30-40 μl 纯化DNA产物的量）， 10 μl 酶混合物，并加至终体积 100 μl 通过添加无核酸酶水。
  2. 用移液器轻轻混匀溶液，离心混合物，并在 37 °C 过夜。
  3. 反应结束后，必须去除DNA模板。加入RQ1无RNase的DNase，使其终浓度为1 U/μg 模板DNA，并在4小时内孵育 37 °C 以消化DNA模板。
  4. 4小时后，加入1体积柠檬酸饱和酚:氯仿:异戊醇（125:24:1，pH 4.7）提取RNA，涡旋混匀约1分钟，于16,000 × g离心 g 2 分钟。
  5. 将上层水相转移至新离心管中，或使用微量移液器吸除下层有机相。加入1体积氯仿:异戊醇（24:1），涡旋混匀1分钟，然后按照4.4步骤进行离心。
  6. 将上层水相转移至新离心管中，或使用微量移液器吸除下层有机相。可通过微型离心机短暂离心（10秒）使残留的氯仿沉降至下层，再用微量移液器吸除下层相。此步骤中，去除下层相比去除上清液更为方便。
  7. 为沉淀 RNA，加入 0.1 体积的 3M 乙酸钠（pH 5.2）和 1 体积的 2-丙醇。混匀后置于 -20 °C -80°C 冰箱中冷冻 15 分钟
  8. 15 分钟后，以最高速度离心，最好在预冷的微量离心机中进行 4 °C，静置20-30分钟以沉淀RNA产物。
  9. 小心吸去上清液，用 0.5 ml 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，离心 4 °C 用移液器吸除乙醇。
  10. 将含有RNA沉淀的离心管转移至金属加热块中，在以下条件下干燥沉淀： 37 °C 5 分钟。
  11. 将RNA样品溶解于150 mM STE缓冲液（pH 8.0，随illustra ProbeQuant G-50微柱提供）或无核酸酶水中，体积与之相同 体外 转录反应，即， 100 μl （步骤 4.1）
  12. 将含有 RNA 产物的试管加热至 70 °C 在加热块中孵育10分钟，并用涡旋振荡器混匀以促进RNA溶解。
  13. 室温下以最高速度离心1分钟。
  14. 保持1-μl 将RNA分装至已标记的0.6 ml离心管中，用于闪烁计数及TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（第6部分）。

第5部分：去除未掺入的核苷酸、RNA脱盐及闪烁计数

为去除未掺入的核苷酸，根据制造商说明书使用两个 G-50 柱。

  1. 倒置柱子，并通过涡旋震荡混匀以重悬树脂。
  2. 使用试剂盒中提供的塑料工具，在柱子底部闭合处的穿孔位置折断，注意保持出口端不受影响。将盖子松开四分之一圈，然后将柱子放入G-50试剂盒中提供的干净收集管中。
  3. 将收集管中的柱子在730 × g下离心 g 1 分钟，以去除保存缓冲液。
  4. 将层析柱转移至两个新的带O形圈盖帽的1.6 ml离心管中，并上样 50 μl 的 32每列直接上样P标记的RNA样品至树脂，避免扰动树脂。
  5. 730 × g 离心 g 孵育2分钟以收集纯化的标记RNA。此步骤后，弃去层析柱。
  6. 转移 1 μl 将经G-50纯化的RNA加入0.6 ml离心管中，用于闪烁计数和电泳（第6部分）。将RNA储备液置于-80 °C保存。20 °C 直至用于SELEX实验。建议在标记后2天内使用RNA，以避免其降解和活性丧失。
  7. 使用两个1-μl 步骤 4.14 和 5.6 中的 RNA 等分试样，用于测量每分钟计数（cpm/μl使用闪烁计数器进行检测。此处，我们采用 Triathler 台式闪烁计数器。
  8. 将含有RNA样本的离心管转移至用于塑料适配器内 32使用Triathler进行P计数。将试管和适配器放入计数室内，关闭计数室盖子，选择 32P计数，然后按开始以进行计数。
  9. 计算标记物掺入率，即 α 的掺入百分比32P-CTP = (cpm/μl 用于“G-50”样品 ÷ cpm/μl （针对“TOTAL”样本）× 100。TOTAL 样本指 G-50 纯化前的样本。
  10. 在闪烁计数并计算掺入率百分比后，计算RNA的产量和RNA的比活性。例如，若某RNA混合物在纯化前的计数为（237370 cpm/μl）以及G-50纯化后（191330 cpm/μl）可实现81%的掺入率，随后在计算RNA产率之前需进行以下计算：

    从步骤 4.1 起，α 的量32P-CTP（3000 Ci/mmol） 10 μCi/μl 是：
    放射性标记计算公式；μCi、Ci、mmol换算过程；分析化学方程式.
    未标记的CTP使用量为：
    摩尔浓度换算公式，显示换算为皮摩尔（pmol）。.
    所用CTP的总量为100006.7 pmol。RNA的分子量计算方法如下
    静态平衡计算，公式：\((100bp-17bp)\times\frac{321.45g/mol}{1bp}-61.96\frac{g}{mol}\)。
    其中 321.45 g/mol27 是rNTP的平均分子质量，100 bp为序列中的碱基数，17 bp为T7启动子中不被转录的碱基数。从寡核苷酸分子量中减去61.96 g/mol，用于校正HPO的去除。2 (63.98) 以及两个氢原子的加入 (2.02)27由于在4种rNTP中，CTP是限制性试剂，若所有CTP均被掺入，则理论上产生的RNA质量应为：
    质量换算公式；显示 \( \frac{pg}{pmol} \times pmol = \mu g \)；计算结果示意图。.
    然而，由于掺入率为81%，该质量现在 2156 μg每分钟计数 μg RNA 的量将随之
    放射性计算公式，100μL × 191330cpm/μL ÷ 2156μg = 8874cpm/μg，科学计数法。
    其中 100 μl 是转录反应体系的体积，以摩尔数表示： 26618.4 μg/μmol x 8874 cpm/μg=2.4×108 cpmμmol由此可计算用于与蛋白质孵育的RNA的物质的量（nmol）及其相应体积，例如， 5 μl RNA将含有约4 nmol的RNA，即
    放射性活度浓度计算公式；涉及使用 cpm/µl 和 µmol 进行单位换算。
    在这些实验中，使用了 300 pmol 至 1 nmol 蛋白质和 4 nmol 至 100 nmol RNA21.

第6部分：通过电泳和放射自显影对RNA产物进行表征

  1. 为准备电泳样品，分别使用步骤 4.14 和 5.6 中 G-50 纯化前后的 1-μl RNA 等分试样。加入 4 μl STE 缓冲液和 5 μl 2x Novex TBE-尿素上样缓冲液。
  2. 将样品在 70 °C 下加热 5 分钟，这是 RNA 电泳通常推荐的步骤（但在本实验条件下发现加热并非必需，因为加热与不加热的 RNA 样品在凝胶分辨率上相同）。
  3. 在电泳装置中组装一块 6% TBE-尿素-聚丙烯酰胺凝胶，内槽和外槽均加入 1x Novex TBE-尿素电泳缓冲液。用 1-ml 移液枪吸取缓冲液冲洗预制胶的加样孔。
  4. 离心 RNA 样品管，使用凝胶上样吸头将样品（总共 10 μl）上样。以 180 V 电压电泳 50 分钟。
  5. 50 分钟后，拆卸凝胶装置，掰开塑料模具，取下并丢弃较短的凝胶背板，但保留较长的背板作为凝胶的支撑。
  6. 用 Decon（或其他适当的放射性去污剂）清洁工作区域表面，确保清除所有放射性污染点。
  7. 铺开两层塑料保鲜膜，将凝胶连同塑料背板一起用双层保鲜膜包裹。
  8. 在暗室安全灯下，将包好的凝胶置于自显影曝光盒内的 X 射线胶片上进行曝光。将曝光盒置于 -20 °C 下 60–90 分钟。
  9. 60–90 分钟后，在暗室安全灯下使用自动胶片显影仪显影胶片（图 2）。

第7部分：RNA与蛋白质孵育及滤膜结合

首先，将RNA与蛋白质在溶液中共同孵育，然后将结合到蛋白质上的RNA序列与未结合的RNA分离开来。随着SELEX循环的进行，滤膜结合实验将反映出蛋白质与RNA结合能力的富集情况。

  1. 将RNA在90 °C下孵育10分钟以进行变性，随后在室温下缓慢复性10分钟。
  2. 用8 μl 60 mM NaOH溶解第2.12步中的蛋白质，并加入36 μl无核酸酶的去离子水。将混合物超声处理1分钟，然后加入36 μl 2x RNA结合缓冲液（20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 7.5）。
  3. 将适量RNA与20 μl 10x RNA结合缓冲液混合，并用无核酸酶水补至总体积为200 μl。将该管标记为“阴性对照”。
  4. 将20 μl蛋白质与所需量的RNA混合，加入20 μl 10x RNA结合缓冲液，并用无核酸酶水补至总体积为200 μl。将该管标记为“反应管”。
  5. 混合各管并在室温下孵育30分钟。在此期间，准备下一操作所需的滤膜和过滤结合装置。
  6. 将一个125 ml侧臂烧瓶连接至真空进气口。在侧臂烧瓶上放置一个预先清洗过的多孔玻璃滤座。
  7. 在35×10 mm培养皿中，用2–3 ml 1x RNA结合缓冲液平衡3张滤膜，持续10–15分钟。第一张滤膜用于调节真空吸力，第二张用于单独RNA的阴性对照滤膜结合，第三张用于RNA-蛋白质混合物的滤膜结合。
  8. 孵育30分钟后，在室温下以最高速度离心结合反应管和对照管5分钟。
  9. 开启真空泵，将第一张滤膜置于多孔玻璃滤座上。使用移液器将0.5 ml RNA结合缓冲液逐滴加至滤膜上，并调节真空度，使每滴缓冲液缓慢通过滤膜。
  10. 将第二张滤膜置于多孔玻璃滤座上，以相同的流速将阴性对照样品加至滤膜上。
  11. 用4次每次0.5 ml的1x RNA结合缓冲液冲洗滤膜，并弃去穿滤液。注意：若需进行预清除，应保留穿滤液用于RNA提取。预清除可去除与滤膜结合的RNA序列。
  12. 取下阴性对照滤膜，放入相应标记的1.6 ml离心管中，用于闪烁计数。
  13. 更换为另一块预先清洗过的多孔玻璃滤座。
  14. 将第三张滤膜置于多孔玻璃滤座上，加入反应混合物。按步骤7.11的方法洗涤滤膜，并弃去穿滤液。在后续SELEX循环中可增加洗涤次数，以提高SELEX条件的严谨性。
  15. 取下滤膜，放入标记为“反应混合物”的1.6 ml离心管中，用于闪烁计数。
  16. 按步骤5.8进行闪烁计数，并记录各滤膜的计数结果。
  17. 计算滤膜结合的放射性占施加至滤膜的总放射性的比例（%结合）。该数值可反映SELEX过程中结合富集的程度。

第8部分：从滤膜中提取RNA

从滤膜中提取RNA，以获得与蛋白质结合的序列。这些序列将被扩增用于下一轮SELEX循环。

  1. 闪烁计数后，从试管中取出结合反应滤膜（来自步骤 7.15），并放入洁净干燥的 35×10 mm 培养皿中。
  2. 使用洁净的手术刀和镊子将膜切成小片。
  3. 用镊子将切割后的膜碎片放回步骤 8.1 中对应标记的试管中。
  4. 加入 400 μl 洗脱缓冲液（7 M 尿素，3 mM EDTA，100 mM 柠檬酸钠，pH 5.0），在 95 °C 下孵育 10 分钟。
  5. 在室温下以最高速度离心试管，吸除上清液，并将提取缓冲液收集至新的标记试管中。
  6. 通过闪烁计数测定含有膜碎片的试管中残留的放射性计数，以评估提取效率。
  7. 重复提取过程（步骤 8.4–8.6）三次。三次提取后的效率通常为 ~95–96%。
  8. 在含有 RNA 提取物的试管中，加入 1 体积（400 μl）柠檬酸盐饱和（pH 4.7）苯酚:氯仿:异戊醇（125:24:1）。涡旋混合约 1 分钟，然后在 16,000 g 下离心 2 分钟。
  9. 将上层水相转移至新试管，或用移液器吸除下层有机相。
  10. 加入 1 体积氯仿:异戊醇（24:1），涡旋混合 1 分钟，在 16,000 g 下离心 2 分钟。
  11. 将上层水相转移至新试管，或用移液器吸除下层有机相。
  12. 为沉淀 RNA，加入 0.1 体积 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、3–4 μl 糖原（10 μg/μl，作为 RNA 共沉淀剂）以及 1 体积等量的 2-丙醇。混匀后置于 -20 °C 冰箱中过夜。
  13. 以最高速度离心（建议在 4 °C 下使用微量离心机）20–30 分钟，使步骤 8.12 中的 RNA 沉淀。
  14. 离心后，RNA 以极难观察到的液相形式沉淀。小心吸除上清液，避免扰动试管底部极难观察到的沉淀相。
  15. 用 0.5 ml 70% 乙醇洗涤 RNA“沉淀”，在 4 °C 下以最高速度离心 5 分钟，通过吸除去除乙醇，避免扰动极难观察到的沉淀相。
  16. 将 RNA 沉淀溶解于 50 μl STE 缓冲液中，并按步骤 5 进行 G-50 纯化。

第9部分：继续进行SELEX循环的逆转录与PCR

为了进行下一轮SELEX循环，需要将RNA逆转录为DNA，并通过PCR进行扩增。

  1. 在5个已标记的0.6 ml离心管中，将3 μl经纯化并经G-50脱盐处理的RNA与2 μl稀释8倍的反向引物混合。将其中一个管标记为“阴性对照”。
  2. 将混合物在70 °C孵育5分钟，然后置于冰上再孵育5分钟，以使引物与RNA杂交。
  3. 在冰上的该混合物中，加入6.4 μl无核酸酶水、4 μl ImProm-II 5×反应缓冲液、1.6 μl 25 mM MgCl2、1 μl 10 mM dNTP混合物、1 μl RNasein核糖核酸酶抑制剂和1 μl ImProm-II反转录酶，总体积为15 μl。
  4. 对于阴性对照，加入7.4 μl无核酸酶水，并不加入反转录酶。相应地标记各管。设置阴性对照是为了验证前一轮循环中可能残留的DNA不会在下一轮SELEX循环中被扩增。此步骤用于检测在步骤4.3中使用RQ1无RNase DNase消化DNA模板的效果。
  5. 使用PCR仪将反应混合物在25 °C孵育5分钟，42 °C孵育1小时，分别用于第一链DNA的退火和延伸，随后在70 °C孵育15分钟以灭活反转录酶。
  6. 反转录反应完成后，配制PCR反应体系。在所有管中加入30 μl无核酸酶水、10 μl 10×Taq缓冲液、30 μl 25 mM MgCl2、7 μl 10 mM dNTP混合物、每种引物各1 μl以及1 μl Taq DNA聚合酶。
  7. 按照第3部分的PCR程序运行9–14个循环。
  8. 按照步骤3.3的方法纯化DNA产物。
  9. 将8 μl DNA产物与2 μl DNA上样染料混合，在2%琼脂糖凝胶中以100 V电泳15–20分钟（图3）。
  10. DNA产物可按照第4部分进行转录以生成标记的RNA，并用于下一轮SELEX循环。

第10部分：代表性结果

在SELEX实验中，用作靶标的Aβ40寡聚体的性质、每轮循环所用RNA的质量，以及每轮循环后RNA的提取与扩增是否成功均至关重要。我们在纯化并去除交联试剂后，采用PICUP方法制备寡聚化的Aβ40混合物用于SELEX。第2部分所述的脱盐实验通常会导致约50–55%的蛋白损失。可通过吸光度测定（λ=280）和SDS-PAGE（图1）评估蛋白的含量与质量。图1展示了5次独立实验中Aβ40洗脱液的平均吸光度谱图，叠加其中一次实验典型的SDS-PAGE分析结果。数据表明，蛋白始终在第3至第5组分中从层析柱中洗脱，而交联试剂在第6组分之后洗脱（第7组分吸光度升高，见图1）。SDS-PAGE显示了典型的Aβ40寡聚体分布22。在蛋白组分经冻干（2.11）、HFIP处理（2.11）、再溶解（7.1）后，再次通过SDS-PAGE分析，该分布结果具有可重复性。

每个SELEX循环中RNA的完整性对于SELEX的迭代进程也至关重要，尤其是在使用易受核酸酶降解的核糖寡核苷酸时。在RNA扩增和标记后（第4部分），可通过TBE-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳评估标记RNA的质量。图2展示了在G-50纯化前后（第5部分）完整标记RNA产物的典型图谱。

每个SELEX循环后，从滤膜结合（第8部分）中提取RNA，并将其逆转录（第9部分）为DNA，用于PCR扩增（步骤9.5）。随后，使用上一轮循环的DNA模板生成 32P标记的RNA（第4部分），用于下一个循环。如果上一个循环中残留的污染性DNA模板在标记的RNA产物中仍然存在，则 体外 转录反应（第4部分）的效率会降低，从而需要增加筛选循环次数。为控制这一因素，在每次SELEX循环及相应的逆转录PCR反应后，均进行琼脂糖凝胶电泳分析（9.12）。阴性对照反应管（9.4）中无DNA产物表明来自前一轮SELEX循环的DNA模板已被成功去除（图3）。若在阴性对照管中观察到PCR扩增出DNA产物，建议延长RQ1 DNase孵育时间（4.3）。制造商推荐的RQ1 DNase孵育时间为15分钟，但我们发现需更长的孵育时间（4–5小时）才能完全去除模板DNA（图3）。

蛋白质纯化；SDS-PAGE 凝胶结果、吸光度图谱；通过电泳进行组分分析。
图1. PICUP 法制备并脱盐的 Aβ40 寡聚体的 SDS-PAGE 凝胶图谱及吸光度曲线。5 次独立脱盐柱所得的吸光度曲线取平均值后叠加于代表性凝胶图谱上。右侧显示分子量标记物。

RNA电泳结果；凝胶图谱；采用电泳法进行RNA分离分析。
图2. RNA产物在G-50纯化前后的TBE-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。RNA产物的迁移方向如图所示，从阴极向阳极移动。

凝胶电泳结果，DNA分离，显示样品与阴性对照，100 bp 标记物。
图 3. 反转录及 PCR 扩增后 DNA 产物的琼脂糖凝胶电泳。

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讨论

SELEX 流程的起始步骤是合成一个随机寡核苷酸文库，通常包含 1012-1015 个序列。在 DNA SELEX 中，该文库在生成单链 DNA（ssDNA）文库后可直接使用；而在此处演示的 RNA SELEX 中，首先需通过体外转录（in-vitro transcription）将 ssDNA 文库酶促转化为 RNA 文库。随后，SELEX 过程以迭代方式进行，每个循环包括寡核苷酸与目标分子的暴露与结合、将结合序列与非结合序列分离，以及结合序列的洗脱。在后续循环中，可调整目标分子与 RNA 的化学计量比和/或洗涤次数，或在结合缓冲液或洗涤缓冲液中加入竞争性抑制剂，以提高 SELEX 条件的严谨性。滤膜结合是一种经典、简单且快速的 SELEX 方法10，尽管已有多种结合与分离方法被报道28。滤膜结合法特别适用于溶液中 RNA 与靶标相互作用的捕获与筛选。当筛选靶标为小分子或肽类时，滤膜结合所用膜的孔径大小会成为限制因素，需予以重点考虑。

洗脱后，与目标物结合的寡核苷酸被扩增...

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致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院/国家衰老研究所（NIH/NIA）资助项目AG030709以及加州公共卫生部资助项目07-65798的支持。我们感谢Margaret M. Condron在多肽合成和氨基酸分析方面的贡献，感谢Elizabeth F. Neufeld博士在项目初期阶段提供的帮助与支持，感谢Chi-Hong B. Chen博士提供支持与试剂，同时感谢Andrew D. Ellington博士富有启发性的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aβ40加州大学洛杉矶分校生物聚合物实验室冻干粉末
MX5 自动化微型天平Mettler Toledo
硅涂层 1.6 ml 离心管Denville ScientificC19033 或 C19035
1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）TCI AmericaH0424需在通风橱中使用。
过硫酸铵Sigma-AldrichA-7460涡旋至溶液澄清。APS 每次现配，且应在 48 小时内使用。
三（2,2-联吡啶）二氯化钌(II)六水合物Sigma-Aldrich224758-1G涡旋至溶液澄清。用铝箔包裹 RuBpy 管以避光。RuBpy 每次现配，且应在 48 小时内使用。
二硫苏糖醇（DTT）Sigma-Aldrich43815
D-Salt™ Excellulose™ 脱盐柱赛默飞世尔科技公司20449
乙酸铵Fisher ScientificA637-500
硅涂层 0.6 ml 离心管Denville ScientificC19063
Novex Tricine 凝胶（10–20%）InvitrogenEC6625B0X10 孔；小型（8 cm × 8 cm）；每孔上样体积 25 μl；分离范围 5 kDa 至 40 kDa
石英比色皿Hellma105.250-QS
Beckman DU 640 分光光度计贝克曼库尔特公司
ssDNA 文库Integrated DNA Technologies定制订购该文库设计包含 49 个随机核苷酸，两侧为含有引物结合位点和克隆位点的恒定区域：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’
Taq DNA 聚合酶USB Corp., Affymetrix71160提供重组 Thermus aquaticus DNA 聚合酶，附带 10× PCR 缓冲液和单独的 25 mM MgCl2 溶液，用于常规 PCR。
PCR 核苷酸混合液，10 mM 溶液USB Corp., Affymetrix77212（每种 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 10 mM）
正向引物Integrated DNA Technologies定制订购5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’
反向引物Integrated DNA Technologies定制订购5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’
PCR 扩增仪Denville ScientificTechne TC-312
QIAquick PCR 纯化试剂盒（50 次）Qiagen28104
琼脂糖Denville ScientificCA3510-8
带 O 形圈密封盖的锥形无菌 1.6 ml 离心管Denville ScientificC19040-S
RiboMAX™ 大规模 RNA 合成系统–T7普洛麦格公司P1300试剂盒包含：120 μl 酶混合液（RNA 聚合酶、重组 RNasin® 核糖核酸酶抑制剂和重组无机焦磷酸酶）；240 μl 转录 5× 缓冲液；每种 4 种 rNTP 各 100 μl，100 mM；110 U RQ1 无 RNase DNase，1 U/μl；10 μl 线性对照 DNA，1 mg/ml；1 ml 3M 醋酸钠（pH 5.2）；1.25 ml 无核酸酶水
α-32P-胞苷-5’-三磷酸，250 μCi（9.25 MBq）PerkinElmer, Inc.BLU008H250UC比活性：3000 Ci（111 TBq）/mmol，50 mM Tricine（pH 7.6）
柠檬酸饱和酚:氯仿:异戊醇（125:24:1，pH 4.7）Sigma-Aldrich77619
氯仿:异戊醇（24:1）Sigma-AldrichC0549
分子生物学级无水乙醇Sigma-AldrichE7023
Z216-MK 制冷微量离心机Denville ScientificC0216-MK
illustra ProbeQuant™ G-50 微型柱GE Healthcare购自 Fisher Scientific（45-001-487）预装 Sephadex™ G-50 DNA 级介质，并预先用含 0.15% Kathon 作为杀菌剂的 STE 缓冲液平衡
Triathler 台式液体闪烁计数器Hidex Oy, Turku, FinlandTriathler LSC 型号：425-034
Novex® TBE-尿素上样缓冲液（2×）InvitrogenLC6876
6% TBE-尿素凝胶，1.0 mm，10 孔InvitrogenEC6865BOX
Novex® TBE 电泳缓冲液（5×）InvitrogenLC6675
放射性去污剂Fisher Scientific04-355-67
凝胶上样枪头Denville ScientificP3080
XCell SureLock Mini-CellInvitrogenEI0001XCell SureLock Mini-Cell
放射自显影胶片Denville ScientificE3018需在完全黑暗中使用
放射自显影胶片，Hyperfilm™ ECLAmershamRPN3114K可在红光安全灯下使用。
膜片EMD MilliporeGSWP02500混合纤维素酯，亲水性，0.22-μm 圆盘膜
125 ml 烧瓶用玻璃砂芯支撑底座VWR international26316-696
培养皿Fisher Scientific08-757-11YZ
尿素Fisher ScientificAC32738-0050
EDTAFisher Scientific118430010
糖原Sigma-AldrichG1767
分子生物学级 2-丙醇Sigma-AldrichI9516
重组 RNase 抑制剂USB Corp., Affymetrix71571
ImProm-II™ 逆转录系统普洛麦格公司A3802
重组 RNase 抑制剂USB Corp., Affymetrix71571
RapidRun™ 上样染料USB Corp., Affymetrix77524

参考文献

  1. Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
  2. Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
  3. Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
  4. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  5. Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
  6. Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
  7. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
  8. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
  9. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  10. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  11. Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
  12. Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
  13. Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
  14. Rhie, A. Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
  15. King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
  16. Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
  17. Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
  18. Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
  19. Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
  20. Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
  21. Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
  22. Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
  23. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
  24. Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
  25. Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
  26. Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
  27. Adams, D. S. Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
  28. Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
  29. Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).

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SELEX 40 RNA PICUP
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