阿尔茨海默病致病因子淀粉样β蛋白的适配体筛选

摘要

适配体是通过筛选获得的短链核糖/脱氧核糖寡核苷酸 体外 基于对特定靶标的亲和力的进化方法。适配体是一类具有广泛应用的分子识别工具，可用于治疗、诊断及科研领域。本文演示针对阿尔茨海默病致病因子——β-淀粉样蛋白——的适配体筛选方法。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性、与年龄相关的神经退行性疾病，病程隐匿，导致其症状前诊断十分困难¹。确诊AD只能在死后完成，因此建立症状前的早期诊断对于开发和实施有效的治疗方案至关重要^2,3。

β-淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中起核心作用。可溶性寡聚态Aβ聚集体被认为参与介导神经毒性，导致AD中突触功能障碍和神经元丢失^4,5已描述了多种形式的可溶性Aβ聚集体，然而，它们之间的相互关系及其在阿尔茨海默病病因学和发病机制中的作用复杂，尚不明确。⁶特定的分子识别工具可能揭示Aβ聚集体之间的相互关系，并有助于在疾病症状出现之前早期检测和表征这些聚集体。分子识别通常依赖于抗体。然而，另一类分子识别工具——适配体（aptamers），相较于抗体具有重要优势^7,8. 适配体是由寡核苷酸通过 体外 筛选：指数富集配体系统进化（SELEX）^9,10SELEX 是一个迭代过程，类似于达尔文进化，可实现特定性质的选择、扩增、富集和延续，例如高亲和力、特异性的配体结合（适体）或催化活性（核酶和脱氧核酶）。

尽管适体（aptamers）已逐渐成为现代生物技术和医学中的重要工具¹¹，但其在淀粉样蛋白研究领域中的应用仍显不足。目前仅有少数RNA或单链DNA适体被筛选出来靶向不同形式的朊病毒蛋白（PrP）^12-16。一项针对重组牛PrP生成的RNA适体被证实可识别牛PrP-β¹⁷，即全长PrP的一种可溶性、寡聚态、富含β-折叠的构象变体，该变体能够形成淀粉样纤维¹⁸。使用单体及多种形式的纤维状β₂-微球蛋白（β₂m）筛选获得的适体，也被发现除了结合β₂m纤维外，还能结合某些其他淀粉样蛋白的纤维结构¹⁹。Ylera et al. 报道了针对固定化单体Aβ40筛选获得的RNA适体²⁰，出乎意料的是，这些适体主要结合纤维态Aβ40。总体而言，这些数据引出了若干重要问题：为何针对单体蛋白筛选的适体能够识别其多聚体形式？是否可以获得靶向淀粉样蛋白单体和/或寡聚体形式的适体？为回答这些问题，我们尝试针对通过未修饰蛋白光诱导交联技术（PICUP）生成的共价稳定化寡聚态Aβ40²¹进行适体筛选^22,23。与先前研究结果类似^17,19,20，这些适体可与Aβ纤维以及多种其他淀粉样蛋白的纤维发生反应，很可能识别了一种潜在共有的淀粉样结构表位（aptatope）²¹。本文中，我们展示了用于生产这些适体的SELEX技术方法²¹。

方案

第1部分：蛋白质制备与交联

最初，用于SELEX的蛋白质需用1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）进行预处理，以获得均一且无聚集物的样品，具体方法如前所述²³。此步骤是必要的，因为预先形成的聚集物会诱导淀粉样蛋白快速聚集，导致实验重复性差²⁴，并且不利于针对未聚集、非纤维化形式的蛋白质筛选适配体。

1. 使用微量天平称取约 800 μg（约 180 nmol）纯 Aβ40。将干燥的冻干肽转移至已标记的、硅化处理的低吸附性 1.6 ml 微量离心管中。
2. 按照先前所述方法²³，用 100% 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP，400 μl）溶解肽，得到 0.5 mM 的肽溶液。
3. 将该溶液分成四份，每份 100 μl，使每个管中名义上含有约 45 nmol Aβ40。随后按照先前所述方法²³去除 HFIP。
4. 在将经 HFIP 处理的肽溶于缓冲液以进行交联反应之前，配制交联和终止反应试剂。称取过硫酸铵（APS，分子量 228.2 g/mol），用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）配制成 40 mM 溶液。使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。
5. 用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）配制 2 mM 的三（2,2'-联吡啶）二氯化钌(II)六水合物（RuBpy，分子量 748.....

讨论

SELEX 流程的起始步骤是合成一个随机寡核苷酸文库，通常包含 10¹²-10¹⁵ 个序列。在 DNA SELEX 中，该文库在生成单链 DNA（ssDNA）文库后可直接使用；而在此处演示的 RNA SELEX 中，首先需通过体外转录（in-vitro transcription）将 ssDNA 文库酶促转化为 RNA 文库。随后，SELEX 过程以迭代方式进行，每个循环包括寡核苷酸与目标分子的暴露与结合、将结合序列与非结合序列分离，以及结合序列的洗脱。在后续循环中，可调整目标分子与 RNA 的化学计量比和/或洗涤次数，或在结合缓冲液或洗涤缓冲液中加入竞争性抑制剂，以提高 SELEX 条件的严谨性。滤膜结合是一种经典、简单且快速的 SELEX 方法¹⁰，尽管已有多种结合与分离方法被报道²⁸。滤膜结合法特别适用于溶液中 RNA 与靶标相互作用的捕获与筛选。当筛选靶标为小分子或肽类时，滤膜结合所用膜的孔径大小会成为限制因素，需予以重点考虑。

洗脱后，与目标物结合的寡核苷酸被扩增.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aβ40	加州大学洛杉矶分校生物聚合物实验室		冻干粉末
MX5 自动化微型天平	Mettler Toledo
硅涂层 1.6 ml 离心管	Denville Scientific	C19033 或 C19035
1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）	TCI America	H0424	需在通风橱中使用。
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A-7460	涡旋至溶液澄清。APS 每次现配，且应在 48 小时内使用。
三（2,2-联吡啶）二氯化钌(II)六水合物	Sigma-Aldrich	224758-1G	涡旋至溶液澄清。用铝箔包裹 RuBpy 管以避光。RuBpy 每次现配，且应在 48 小时内使用。
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	43815
D-Salt™ Excellulose™ 脱盐柱	赛默飞世尔科技公司	20449
乙酸铵	Fisher Scientific	A637-500
硅涂层 0.6 ml 离心管	Denville Scientific	C19063
Novex Tricine 凝胶（10–20%）	Invitrogen	EC6625B0X	10 孔；小型（8 cm × 8 cm）；每孔上样体积 25 μl；分离范围 5 kDa 至 40 kDa
石英比色皿	Hellma	105.250-QS
Beckman DU 640 分光光度计	贝克曼库尔特公司
ssDNA 文库	Integrated DNA Technologies	定制订购	该文库设计包含 49 个随机核苷酸，两侧为含有引物结合位点和克隆位点的恒定区域：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’
Taq DNA 聚合酶	USB Corp., Affymetrix	71160	提供重组 Thermus aquaticus DNA 聚合酶，附带 10× PCR 缓冲液和单独的 25 mM MgCl2 溶液，用于常规 PCR。
PCR 核苷酸混合液，10 mM 溶液	USB Corp., Affymetrix	77212	（每种 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 10 mM）
正向引物	Integrated DNA Technologies	定制订购	5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’
反向引物	Integrated DNA Technologies	定制订购	5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’
PCR 扩增仪	Denville Scientific	Techne TC-312
QIAquick PCR 纯化试剂盒（50 次）	Qiagen	28104
琼脂糖	Denville Scientific	CA3510-8
带 O 形圈密封盖的锥形无菌 1.6 ml 离心管	Denville Scientific	C19040-S
RiboMAX™ 大规模 RNA 合成系统–T7	普洛麦格公司	P1300	试剂盒包含：120 μl 酶混合液（RNA 聚合酶、重组 RNasin® 核糖核酸酶抑制剂和重组无机焦磷酸酶）；240 μl 转录 5× 缓冲液；每种 4 种 rNTP 各 100 μl，100 mM；110 U RQ1 无 RNase DNase，1 U/μl；10 μl 线性对照 DNA，1 mg/ml；1 ml 3M 醋酸钠（pH 5.2）；1.25 ml 无核酸酶水
α-32P-胞苷-5’-三磷酸，250 μCi（9.25 MBq）	PerkinElmer, Inc.	BLU008H250UC	比活性：3000 Ci（111 TBq）/mmol，50 mM Tricine（pH 7.6）
柠檬酸饱和酚:氯仿:异戊醇（125:24:1，pH 4.7）	Sigma-Aldrich	77619
氯仿:异戊醇（24:1）	Sigma-Aldrich	C0549
分子生物学级无水乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
Z216-MK 制冷微量离心机	Denville Scientific	C0216-MK
illustra ProbeQuant™ G-50 微型柱	GE Healthcare	购自 Fisher Scientific（45-001-487）	预装 Sephadex™ G-50 DNA 级介质，并预先用含 0.15% Kathon 作为杀菌剂的 STE 缓冲液平衡
Triathler 台式液体闪烁计数器	Hidex Oy, Turku, Finland	Triathler LSC 型号：425-034
Novex® TBE-尿素上样缓冲液（2×）	Invitrogen	LC6876
6% TBE-尿素凝胶，1.0 mm，10 孔	Invitrogen	EC6865BOX
Novex® TBE 电泳缓冲液（5×）	Invitrogen	LC6675
放射性去污剂	Fisher Scientific	04-355-67
凝胶上样枪头	Denville Scientific	P3080
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001	XCell SureLock Mini-Cell
放射自显影胶片	Denville Scientific	E3018	需在完全黑暗中使用
放射自显影胶片，Hyperfilm™ ECL	Amersham	RPN3114K	可在红光安全灯下使用。
膜片	EMD Millipore	GSWP02500	混合纤维素酯，亲水性，0.22-μm 圆盘膜
125 ml 烧瓶用玻璃砂芯支撑底座	VWR international	26316-696
培养皿	Fisher Scientific	08-757-11YZ
尿素	Fisher Scientific	AC32738-0050
EDTA	Fisher Scientific	118430010
糖原	Sigma-Aldrich	G1767
分子生物学级 2-丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
重组 RNase 抑制剂	USB Corp., Affymetrix	71571
ImProm-II™ 逆转录系统	普洛麦格公司	A3802
重组 RNase 抑制剂	USB Corp., Affymetrix	71571
RapidRun™ 上样染料	USB Corp., Affymetrix	77524