胚胎干细胞向少突胶质细胞前体的分化

摘要

我们介绍一种基于小分子的方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为少突胶质前体细胞（OPCs）。该方案可在30天内高效地生成Olig2+NG2+的OPCs。我们还描述了一种生成“可放电”OPCs的方法，这类细胞能够产生动作电位。

摘要

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞。在脱髓鞘性疾病的再生细胞治疗中，人们迫切希望获得纯化的、已定向分化的少突胶质前体细胞（OPCs）用于移植。OPCs 的特征是表达转录因子 Olig2 并在细胞表面表达蛋白聚糖 NG2。利用 GFP-Olig2（G-Olig2）小鼠胚胎干细胞（mESC）报告细胞系，我们优化了将 mESCs 诱导分化为 GFP+Olig2+NG2+ OPCs 的条件。在本实验方案中，我们首先描述了由 mESCs 生成拟胚体（EBs）的方法；其次，描述了在特定培养条件下，使用小分子物质处理 mESC 来源的拟胚体：（1）视黄酸（RA）和（2）音猬因子（Shh）激动剂嘌呤霉素（Pur），以引导拟胚体向少突胶质细胞谱系分化。通过该方法，可在 30 天内以高效率（>80%）获得 OPCs。本方案中由 mESCs 分化而来的细胞在表型上与来源于原代组织培养的 OPCs 相似。然而，mESC 来源的 OPCs 并不表现出脑内部分 OPC 亚群原位所具有的放电特性。为了研究这一电生理特性，我们描述了通过异位表达 Na_V1.2 亚基。通过本方案获得的放电型和非放电型细胞将有助于推进对少突胶质前体细胞（OPC）两个亚群的功能研究。

方案

由GFP-Olig2小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成少突胶质前体细胞（OPCs）的详细步骤：

1. 小鼠胚胎干细胞系 GFP-Olig2 (G-Olig2) 购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。这些小鼠胚胎干细胞 (mESC) 通常每 3 天传代一次，接种至经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 饲养层上。MEF 细胞需至少提前一天接种于经 0.1% 明胶包被的六孔组织培养板中。小鼠胚胎干细胞培养基为添加了 20% 胎牛血清 (GIBCO)、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM β-巯基乙醇、1% 非必需氨基酸 (NEAA) 和 1,000 U/ml 白血病抑制因子的杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM) (GIBCO)。
2. 将 mESC 克隆用胰蛋白酶 (TrypLE, 5 分钟, 37°C) 消化为单细胞，并悬浮于含 knockout 血清替代物 (KSR) 的培养基中，随后以 50,000 个细胞/cm² 的密度接种至 Costar 超低吸附六孔板 (Corning) 中。在此条件下，mESC 形成类胚体 (EB)。KSR 培养基由添加了 20% KSR、1 mM 丙酮酸钠、1% NEAA 和 0.1 mM β-巯基乙醇的最低必需培养基 (-MEM) 组成。
3. 从第 4 天至第 7 天，在 KSR 或 N2 培养基中加入视黄酸 (RA, 0.2 M) 和嘌呤霉素 (Pur, 1 M)，如图 1A 所示。N2 培养基为含 1× N2 补充剂、1 mM 丙酮酸钠、1% NEAA 和 0.1 mM β-巯基乙醇的 -MEM。培养基每天更换一次。
4. 第 8 天，使用 TrypLE (5 分钟, 37°C) 将类胚体 (EB) 解离，并接种至经 0.01% 多聚鸟氨酸包被的培养皿中，培养基为含 N2 培养基和成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2, 20 ng/ml) 的 OPC 培养基。培养基每两天更换一次。
5. 当细胞生长至融合状态时，约每周用胰蛋白酶 (TrypLE, 3 分钟, 37°C) 消化并重新接种一次。第 30 天时，超过 80% 的细胞呈现 GFP/Olig2 表达且为 NG2 阳性，符合少突前体细胞 (OPC) 的特征。
6. 为生成可产生动作电位的 OPC，使用 BacMam Na⁺ 通道试剂盒将 Na_v1.2 亚基导入这些 mESC 来源的 OPC 中。将 BacMam 试剂 (1 ml, 组分 A) 用 PBS 稀释至终体积为 5 ml。然后，在用 PBS 洗涤前，将混合后的 BacMam 试剂加入 60 mm 培养皿中（细胞融合度为 50–70%）的 mESC 来源 OPC 培养物中。37°C 孵育 2 小时后，移除混合的 BacMam 试剂，并更换为添加了 1× 增强剂的 OPC 培养基。增强剂为用 DMSO (组分 C) 重悬的组分 B。再孵育 2 小时后，移除含增强剂的培养基，并更换为完全 OPC 培养基。24 小时后进行细胞检测。

代表性结果：

按照图1A所示的分化方案，G-Olig2小鼠胚胎干细胞（mESCs）最初悬浮于KSR培养基中培养4天，以形成拟胚体（EBs）（图1B）。随后，我们依次使用RA和Pur处理这些拟胚体。在第4天时，拟胚体未显示任何GFP荧光，而在第8天（D8）则表现出强烈的GFP荧光（图1B）。此时，将拟胚体用胰蛋白酶消化并接种至添加了生长因子FGF-2的N2培养基中。再继续培养22天后（D30），根据流式细胞术结果，GFP阳性细胞的比例达到80.3 ± 0.6%。如图1C所示，GFP阳性细胞与NG2染色结果高度重叠（GFP阳性细胞中96.4 ± 1.3%为NG2阳性，NG2阳性细胞中94.8 ± 1.5%为GFP阳性）。因此，这些细胞同时表达GFP/Olig2和NG2，被定义为少突胶质前体细胞（OPCs）。

mESC 分化而来的 OPC（76 个细胞）在去极化时无法产生动作电位（图 2A）。在转导携带 Na_v1.2 亚基的杆状病毒后，这些 mESC 分化而来的 OPC 中有 94.1%（17 个细胞中的 16 个）可被归类为能够产生放电的细胞（图 2B）。

图1. GOlig-mESC向少突前体细胞（OPC）的分化。 （A）示意图显示基于拟胚体（EB）并由小分子驱动的分化流程。在第8天（D8），将EB解离并接种。当细胞生长至融合状态时，每周传代一次。（B）第8天（D8）的EB显示出GFP表达，而第4天（D4）的EB则无GFP表达。（C）在第30天（D30），NG2免疫染色（红色）的表达模式与GFP（绿色）表达一致。DAPI（蓝色）用于标记细胞核。比例尺：20 mm。

图2. 通过病毒介导的Na_v通道表达将非放电型mESC来源的少突前体细胞转化为放电型OPC。 （A）膜电位维持在-60 mV时，mESC来源的少突前体细胞无法产生动作电位，即使将细胞去极化至0 mV亦无反应。（B）mESC来源的少突前体细胞在病毒转导后产生动作电位（以红色高亮显示）的示例。

讨论

胚胎干细胞（ESCs）来源于囊胚期胚胎，可分化为生物体的所有细胞谱系 ^{3, 4}，提供一个 体外 研究早期哺乳动物发育（包括少突胶质细胞特化）的模型系统。研究表明，在 sonic hedgehog (Shh) 处理下，小鼠胚胎干细胞（mESCs）可分化为少突胶质细胞前体细胞（OPCs） ⁵此外，Shh诱导的mESCs向OPC的分化保留了胚胎发育过程中观察到的正确时间顺序 ⁶因此，其性质 体外 mESCs 分化为 OPC 的过程被认为与已从研究中获得的认知相一致 体内 发育。在此，我们利用小分子RA和Shh激动剂Pur，成功将G-Olig2 mESCs高效分化为GFP+Olig2+NG2+少突胶质前体细胞（OPCs）。

表达蛋白聚糖NG2的少突胶质前体细胞（OPCs） ⁷ 以及螺旋-环-螺旋转录因子 Olig2 ⁸，可在发育中和成熟的中枢神经系统中生成少突胶质细胞，这些细胞约占中枢神经系统总细胞数的显著比例（约 5%），是主要的增殖性细胞类型 ⁹近二十年来，研究人员已证明 Na_V 通道在少突胶质前体细胞的一个亚群中表达，并可在去极化时被激活 ^{10, 11}此外，最近一项引人注目的发现⁹ 是在 原位 大鼠中枢神经系统白质中的少突胶质前体细胞（OPCs，约50%）在去极化时可产生动作电位，这取决于电压门控钠（Na⁺）通道的表达情况。_V）通道，因此可进一步细分为产生动作电位和不产生动作电位的亚群。然而，这些产生动作电位特性的功能在很大程度上仍不清楚。我们发现，在电生理学特性上，通过Shh依赖性方案分化获得的mESC来源的少突胶质前体细胞（OPCs）与 原位 脑部少突胶质前体细胞。在引入亚基Na之后_V1.2，这些沉默的mESC来源的OPC能够产生动作电位。

因此，本文所述的小鼠胚胎干细胞（mESC）来源的可放电与非放电少突胶质前体细胞（OPC）及其分化方案可能有助于：（1）研究可放电与非放电 OPC 之间的功能差异；（2）筛选能够促进 mESC 来源 OPC 中钠通道表达的新因子；（3）开发并优化由人胚胎干细胞（ESC）或诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为 OPC 的分化方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）	GlobalStem	GSC-6001G
TrypLE Express	Invitrogen	12604
视黄酸	Sigma-Aldrich	R-2625
Purmorphamine	Cayman Chemical	10009634
成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）	EMD Millipore	GF003
BacMam NaV 1.2	Invitrogen	B10341