双分子荧光互补（附设）检测蛋白质相互作用的洋葱细胞使用的Helios基因枪

Summary

本文介绍了如何正确使用BioRad公司赫利奥斯基因枪引入洋葱表皮细胞的质粒DNA，以及如何测试基于双分子荧光互补的原则（附设）洋葱细胞中的蛋白质 - 蛋白质相互作用

Abstract

在不同生物体的基因功能的研究依赖于基因产物如何彼此互动在正常的细胞环境的知识。双分子荧光互补（附设）含量

Protocol

一，质粒制备

轰击使用的质粒DNA必须是高纯度和浓度500ng/μl或更大。附设涉及两个质粒结构，需要25微克的每个质粒。换句话说，两个质粒的1:1摩尔比混合，给墨盒准备上升​​到50微克质粒DNA总量。要留意超过50微克，增加更多的DNA可能会导致金颗粒的集聚，并应避免。市售的质粒DNA提取试剂盒隔离质粒DNA的建议。

质粒载体应在pUC19中，如规模相对较小。我们克隆到的pUC19 - SPYNE的pUC19 - SPYCE，分别为³的cDNA SEU和LUH。 农杆菌介导的二进制向量过大和不适当的轰击。

二。墨盒准备

墨盒准备涉及涂料与质粒DNA和装入塑料管材，随后削减到半英寸长片，它可以加载到基因枪匣持有的金粒子。墨盒准备在一个单独的朱庇特第⁴条的详细描述，这里没有描述。洋葱细胞的轰击，我们建议12.5毫克每准备金颗粒，产量约在1微克DNA/0.25毫克黄金/盒，50墨盒50微克质粒DNA混合。每个墨盒是一炮打响。金颗粒可以是0.6微米，直径1.0微米（猫＃1652262或Cat＃1652263; BIORAD）。我们还建议使用的墨盒准备为0.5毫克/毫升PVP的解决方案。对于附设，结合每个公认的互动合作伙伴，在相同的墨盒准备的两个质粒DNA。

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Discussion

1. 对于首次用户，我们建议实行整个过程，从墨盒准备观察，用一个单一的质粒构记者如35S::GFP或35S::GUS。我们使用了35S::GFP质粒从博士获得。史蒂夫山和小宁张^6（图1A，D）。不适合植物基因出手控制RioRad（猫165-2244）出售的墨盒。
2. 对于附设，第二个阳性对照是必要的，应当由两个已知的交互融合YFP的C端和N -末端片段的合作伙伴，分别。
3. 对于附设，这是必要的，包括一些负面控制:（1）的YFP的N -端片段，再加上一个向量的C -末端片段编码蛋白质X融合;（2）C -末端片段的融合蛋白Ÿ YFP的加N -端片段编码的一个载体;（3）载体。
4. 可以使用一个扩散屏幕的Helios基因枪桶的基础上，烧成时的出手，这有助于减少组织损伤。在我们的研究中，我们没有使用扩散屏幕。
5. 附设，曝光时间，以激发光介导YFP的荧光显微镜观看期间应尽量减少照片漂白。
6. 存储在闪烁瓶含有干燥剂的墨盒好几个月。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
黄洋葱	任何供应商
Helios Gene Gun	Bio-Rad
荧光显微镜，带有适用于 GFP 或 YFP 的滤光片	蔡司、尼康、奥林巴斯