本文介绍了如何正确使用伯乐（BioRad）Helios基因枪将质粒DNA导入洋葱表皮细胞，以及如何基于双分子荧光互补（BiFC）原理在洋葱细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
研究基因在不同生物体中的功能依赖于了解基因产物在其正常细胞环境中如何相互作用。双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）实验1使研究人员能够可视化活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，并已成为一项重要的研究工具。该实验基于荧光蛋白（GFP）的两个片段在潜在相互作用蛋白的介导下发生促进性结合的原理，其中每个GFP片段分别与一个潜在的相互作用蛋白融合。当两个目标蛋白发生相互作用时，将促进GFP的N端片段与C端片段的结合，从而恢复荧光信号。对于植物研究人员而言，洋葱表皮细胞是进行双分子荧光互补（BiFC）实验的理想体系，因其组织易于获取和制备，且荧光背景极低，可实现荧光信号的直接观察。Helios基因枪（BioRad）常用于将质粒DNA轰击导入洋葱细胞。本文演示了使用Helios基因枪导入两个相互作用蛋白对应的质粒构建体的方法Arabidopsis thaliana转录因子，SEUSS (SEU) 和 LEUNIG HOMOLOG (LUH)2以及通过BiFC在洋葱表皮细胞中可视化它们的相互作用。
方案
一、质粒制备
用于轰击的质粒DNA必须具有高纯度，浓度需达到500 ng/μl或更高。对于涉及两种质粒构建体的双分子荧光互补（BiFC）实验，每种质粒需要25 μg。换句话说，应将两种质粒按1:1的摩尔比混合，总共获得50 μg质粒DNA用于制备基因枪弹。需注意，加入的DNA总量超过50 μg可能导致金颗粒发生聚集，应避免这种情况。建议使用市售的质粒DNA提取试剂盒来分离质粒DNA。
质粒载体的大小应相对较小，例如 pUC19。我们将 SEU 和 LUH 的 cDNA 分别克隆到 pUC19-SPYNE 和 pUC19-SPYCE 中。3二元载体用于 农杆菌介导的转化因体积过大而不适用于轰击。
II. 色谱柱制备
质粒DNA包被金颗粒并将其装入塑料管中，随后将塑料管切割成约半英寸长的小段，即可装入基因枪的弹夹持器中，此过程称为弹夹制备。弹夹制备的详细步骤已在另一篇JoVE文章中有详尽描述4，因此本文不再赘述。在对洋葱细胞进行轰击时，我们建议每次制备使用50 μg质粒DNA与12.5 mg金颗粒混合，可制备约50个弹夹，每个弹夹含1 μg DNA和0.25 mg金颗粒。每个弹夹仅用于一次轰击。金颗粒的直径可选0.6 μm或1.0 μm（产品目录号分别为Cat #1652262或Cat #1652263；Biorad）。我们还建议在弹夹制备过程中使用0.5 mg/ml的PVP溶液。对于双分子荧光互补（BiFC）实验，应将每对疑似相互作用蛋白对应的两种质粒DNA混合后共同用于同一次弹夹制备。
在完成弹药制备后，需通过将新制备的弹药以150至200 psi的氦气压力射向包裹在培养皿上的方形Parafilm膜来测试弹药性能。该步骤用于检测金颗粒是否能有效从弹药中喷射出来；你应在Parafilm膜上观察到微弱的金颗粒痕迹。这可以让你了解每次射击所覆盖的区域范围。在不同氦气压力（150–200 psi范围内）下，你可能会观察到喷射到Parafilm膜上的金颗粒量有所不同。如果差异不显著，则选择较低的压力用于后续轰击实验。
III. 准备洋葱组织
在拍摄当天，剥去一个大黄洋葱的外皮。使用干净且锋利的剃须刀片，在洋葱上切出一个约 2 × 8 cm 的矩形区域，深度达 4-5 层。取出该矩形的洋葱组织，弃去最外层的两层，将剩余的洋葱层切成约 2 × 1.5 cm 的小片。将洋葱片放入含有滤纸（用 Whatman 3MM 滤纸剪成圆形）的培养皿中，滤纸用无菌水润湿。盖上培养皿，即可备用。
IV. 轰击
- 将载弹管装入白色圆形载弹管架中。含有不同质粒构建体的载弹管应分别装入不同的载弹管架中。每个载弹管架最多可容纳12个载弹管，用于12次射击。
- 将电池和新的枪管衬管插入Helios基因枪中。确保枪管衬管和基因枪上均装有相应的O形圈。
- 首先将一个空的载弹管架插入基因枪中，使载弹管架上的标记#12朝向枪的顶部。将载弹管架前进一次或两次，以确保其正确插入。
- 将基因枪连接至氦气罐，并将压力调节至150至200 psi之间。
- 佩戴听力保护装置，并使用空载弹管架多次试射，以清洁枪室并确保压力稳定。
- 取下空载弹管架，插入已装载的载弹管架。推进载弹管架，使待发射的载弹管位于载弹管架底部（6点钟位置）。在此处射击洋葱片可作为背景荧光的阴性对照。
- 将洋葱片放置于空培养皿中央，使洋葱最内层朝上。将基因枪的枪管衬管置于培养皿上，通过按住侧边按钮并拉动扳机来发射。将轰击后的洋葱片转移至含有湿润3MM滤纸的培养皿中。
- 推进至下一个载弹管，并轰击另一片洋葱。重复此步骤，直至轰击4至5片洋葱。每片洋葱仅轰击一次。
- 更换为装有含不同质粒或不同质粒组合载弹管的另一载弹管架。注意同时更换枪管衬管，以防止污染。轰击4至5片新的洋葱片。
- 轰击完成后，将所有洋葱片放回培养皿中。用盖子盖上培养皿，并用Parafilm封口以防止干燥。将洋葱片在室温避光条件下孵育16–48小时。
- 在将基因枪从氦气罐上拆下前，先关闭气体并释放压力。拧下枪管衬管，取出载弹管架以及已使用（或未使用）的载弹管。
- 通过将载弹管架和枪管衬管浸入盛有肥皂水的烧杯中进行清洗。将烧杯放入超声波清洗器中，超声处理20分钟。随后用清水冲洗以去除所有肥皂残留物。再将其浸泡于70%乙醇中一小时，然后在纸巾上晾干。
V. 观察
- 将轰击后的洋葱组织块在室温下孵育16-20小时后，可使用荧光显微镜（例如本研究中使用的Zeiss Axio Observer.z1）观察GFP或YFP荧光。
- 使用平头镊子缓慢剥离洋葱内表皮的单层细胞（即轰击过程中正对基因枪的一侧）。将表皮置于载玻片上的水滴中，加盖盖玻片，注意尽量减少气泡产生。
- 在显微镜明场模式下，首先检查细胞质流动以确认细胞仍存活。为此，将玻片暴露于明场光源数分钟，使洋葱组织升温，然后观察质体是否移动。细胞质流动并不总是容易观察到，若未能看到，也不必气馁。
- 进行荧光检测时，应使用适用于GFP或YFP的激发和检测滤光片。必须设置阴性对照，例如用非荧光质粒轰击的洋葱组织块。受伤细胞、气泡或碎片可能产生微弱的黄色信号。同时应设置阳性对照，含有组成型表达荧光报告基因（如35S::GFP）的质粒是理想的阳性对照。洋葱表皮细胞中可见的GFP信号（图1A、D）表明，基因枪弹、洋葱组织及基因枪轰击操作均正确制备并执行。随后，我们观察了共轰击含有35S::SEU-pSPYNE和35S::LUH-pSPYCE DNA混合物的基因枪弹后，洋葱组织中SEU-pSPYNE与LUH-pSPYCE之间的相互作用。仅在细胞核中检测到微弱的YFP荧光信号（图1B、E），表明SEU与LUH之间存在直接的物理相互作用，使分裂的YFP片段在细胞核内重新结合。需要注意的是，BiFC产生的YFP信号显著弱于35S::GFP产生的GFP信号。
代表性结果
在本研究报道的结果中，35S::GFP 阳性对照质粒发出强烈的荧光，遍布整个细胞，包括细胞核和细胞质（图1A、D）。GFP 蛋白分子量较小，无需核定位信号即可扩散进入细胞核。相比之下，SEU 和 LUH 是两种 拟南芥 先前已在酵母双杂交实验中证实可相互作用的转录因子2SEU-pSPYNE（SEU与YFP的N端片段融合）和LUH-pSPYCE（SEU与YFP的N端片段融合），两者均因分子过大无法扩散进入细胞核，但均含有核定位信号2,5在洋葱细胞核中检测到的YFP荧光信号（图1 B，E）表明SEU-pSPYNE与LUH-pSPYCE可在洋葱细胞核内发生相互作用。而在用含有YFP N端片段的载体质粒pSPYNE与LUH-pSPYCE质粒混合物轰击的洋葱细胞中，未检测到荧光信号（图1 C，F）。
BiFC介导的YFP荧光显著弱于35S::GFP质粒介导的GFP荧光。在本研究中，二者还表现出不同的亚细胞定位（比较图1A与图1B）。此外，BiFC的荧光细胞数量明显较少，因为BiFC只有在两种配体质粒均成功进入并共表达于同一洋葱细胞时才能发挥作用。
图1. 用不同质粒构建体轰击的洋葱细胞的荧光（A, B, C）和明场（D, E, F）图像。（A）和（D），用35S::GFP轰击的洋葱细胞。GFP在细胞质和细胞核中扩散。（B）和（E），用等摩尔混合的35S::SEU-pSPYNE（SEU与YFP的N端片段融合）和35S::LUH-pSPYCE（LUH与YFP的C端片段融合）质粒DNA轰击的洋葱细胞。SEU-pSPYNE与LUH-pSPYCE之间的相互作用表现为细胞核中出现荧光信号。（C）和（F），阴性对照，显示用pUC19-SPYNE载体和LUH-pSPYCE质粒混合物轰击的洋葱细胞，未检测到荧光信号。
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讨论
- 对于初次使用者，我们建议使用单个组成型报告质粒（如 35S::GFP 或 35S::GUS）完整练习整个实验流程，从 cartridge 制备到观察。我们使用的 35S::GFP 质粒由 Steve Mount 和 Xiaoning Zhang 博士提供6（图 1A，D）。RioRad 出售的基因枪控制 cartridge（货号 165-2244）不适用于植物。
- 进行 BiFC 实验时，需要设置第二个阳性对照，该对照应包含已知相互作用的两个蛋白，分别与 YFP 的 C 末端片段和 N 末端片段融合。
- 进行 BiFC 实验时，必须包含多个阴性对照：（1）蛋白 X 与 YFP 的 N 末端片段融合，同时转入编码 YFP C 末端片段的空载体；（2）蛋白 Y 与 YFP 的 C 末端片段融合，同时转入编码 YFP N 末端片段的空载体；（3）仅转入空载体。
- 在使用 Helios 基因枪射击时，可在枪管底部加装扩散屏，以减少组织损伤。在本研究中，我们未使用扩散屏。
- 在显微镜下观察 BiFC 介导的 YFP 荧光时，应尽量缩短激发光照射时间，以减少光漂白。
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致谢
感谢 Steve Mount 博士和 Xiaoning Zhang 博士提供 35S::GFP pGlowbug 载体，以及 Hokensen 博士生奖学金对 C. H. 的资助。Z. L. 实验室的研究工作由美国国家科学基金会（IOB0616096 和 MCB0744752）资助。Z. L. 还部分得到了马里兰大学农业实验站的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 黄洋葱 | 任意供应商 | ||
| Helios 基因枪 | Bio-Rad | ||
| 配备适用于 GFP 或 YFP 滤光片的荧光显微镜 | Zeiss、Nikon、Olympus |
参考文献
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
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重印与许可
