in situ 小鼠胰岛β细胞数量的原位定量分析

摘要

以下方案概述了用于虚拟切片成像的胰腺解剖过程，以及对整个胰腺中所有GFP标记的β细胞进行定量分析的后续步骤。

摘要

追踪特定细胞群体在健康与疾病状态下的变化是生物医学研究的重要目标。监测胰腺β细胞增殖及胰岛生长的过程尤为困难。我们开发了一种方法，利用为ImageJ（rsb.info.nih.gov/ij/）编写的宏程序，对转基因小鼠完整胰腺中荧光标记的β细胞进行成像分析。在完成胰腺解剖和组织透明化处理后，将整个胰腺以虚拟切片形式完整采集，随后检测GFP标记的β细胞。分析内容包括定量总β细胞面积、胰岛数量及其大小分布，并针对每个胰岛及小簇β细胞群提供特定参数和位置信息。整个胰岛分布可进行三维可视化呈现，通过各胰岛的大小与形态分布信息，可直观地对总体β细胞面积的变化进行定性与定量比较。

方案

第1部分：标本制备

1. 将小鼠置于解剖显微镜下，完整取出仍附着十二指肠和脾脏的整个胰腺，并将器官放置在已称重的玻璃载片上。沿十二指肠与胰腺连接侧的结缔组织剪除十二指肠。剪切并去除脾脏以及胰腺上的多余脂肪组织，直至胰腺完全分离并保留在载片上。（胰腺脂肪呈白色，与颜色稍深且偏棕的胰腺组织可明显区分。）
2. 将盖玻片（大号盖玻片 50×75 mm；标准盖玻片 25×75 mm）覆盖在胰腺上，确保完全遮盖。使用重物（例如厚重的书本）压在载片与盖玻片之间，使胰腺压平。根据所用重物的不同，压平过程大约需要五分钟。
3. 取下重物。若胰腺已充分压平贴附于载片上，则将其置于4%多聚甲醛（PFA）中，于4°C固定过夜。次日清晨，取下盖玻片，使整个胰腺在室温下充分暴露于PFA中继续固定6–8小时。若胰腺固定不充分，可延长PFA固定时间，必要时可再过夜。随后将载片转移至含1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）中，4°C孵育过夜。次日，将载片转移至饱和蔗糖溶液中处理1–2天。之后将载片转移至100%甘油中，直至组织完全透明，以获得最佳荧光信号分辨率；组织透明过程通常需要1–3天。（荧光信号可维持数周甚至数月，但为获得最佳成像效果，建议在组织透明后尽快进行成像。）
4. 将胰腺保存在阴暗、低温环境中，以维持器官结构及其荧光信号的稳定性。

第2部分：完整胰腺中β细胞面积的成像与定量

1. 使用镊....

讨论

对完整胰腺中胰岛及β细胞簇的虚拟切片图像进行分析，可提供胰岛整体分布的大尺度视图，从而能够研究并比较不同时期胰岛总分布的发育与变化。我们对胰岛形成过程的分析即为一个典型示例（1）。通过对新生小鼠胰腺在不同时间点（P1-P21）进行系统性分析发现，胰岛是通过分裂方式形成的。虽然在P1至P10阶段，β细胞增殖符合对数正态概率密度函数，但从P12开始，胰岛分布逐渐偏离对数正态模式，呈现左偏趋势，提示存在分裂过程。类似分析也应用于小鼠胰岛素瘤进展过程的研究，其数据符合具有峰值位置和x轴尺度参数的对数正态函数，以及幂律分布（2）：



P(x) = ax^y。数据以面积、周长和Feret直径的三维图形式有效呈现（图1E）。在本研究中，使用了转基因小鼠模型，其中胰腺β细胞在小鼠胰岛素I启动子（MIP）的调控下被绿色荧光蛋白（GFP；3, 4）基因标记。MI.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子	Miltex Inc.
剪刀	F.S.T.	14001-13	01n2
剪刀	F.S.T.	14072-10	02s5
大型载玻片	Electron Microscopy Sciences	71862-01	75x51x1.2mm
大型盖玻片	Ted Pella, Inc.	260462	50x75mm
载玻片	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0mm
盖玻片	Fisher Scientific	12-458-5M	75x25mm
盖玻片	Erie Scientific		25mm 圆形
荧光显微镜	Olympus Corporation
解剖显微镜	Olympus Corporation
Stereo Investigator	MBF Bioscience
MIP-GFP 小鼠	Jackson Laboratory