以下方案概述了用于虚拟切片成像的胰腺解剖过程，以及对整个胰腺中所有GFP标记的β细胞进行定量分析的后续步骤。
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本文内容
摘要
摘要
追踪特定细胞群体在健康与疾病状态下的变化是生物医学研究的重要目标。监测胰腺β细胞增殖及胰岛生长的过程尤为困难。我们开发了一种方法，利用为ImageJ（rsb.info.nih.gov/ij/）编写的宏程序，对转基因小鼠完整胰腺中荧光标记的β细胞进行成像分析。在完成胰腺解剖和组织透明化处理后，将整个胰腺以虚拟切片形式完整采集，随后检测GFP标记的β细胞。分析内容包括定量总β细胞面积、胰岛数量及其大小分布，并针对每个胰岛及小簇β细胞群提供特定参数和位置信息。整个胰岛分布可进行三维可视化呈现，通过各胰岛的大小与形态分布信息，可直观地对总体β细胞面积的变化进行定性与定量比较。
方案
第1部分：标本制备
- 将小鼠置于解剖显微镜下，完整取出仍附着十二指肠和脾脏的整个胰腺，并将器官放置在已称重的玻璃载片上。沿十二指肠与胰腺连接侧的结缔组织剪除十二指肠。剪切并去除脾脏以及胰腺上的多余脂肪组织，直至胰腺完全分离并保留在载片上。（胰腺脂肪呈白色，与颜色稍深且偏棕的胰腺组织可明显区分。）
- 将盖玻片（大号盖玻片 50×75 mm；标准盖玻片 25×75 mm）覆盖在胰腺上，确保完全遮盖。使用重物（例如厚重的书本）压在载片与盖玻片之间，使胰腺压平。根据所用重物的不同，压平过程大约需要五分钟。
- 取下重物。若胰腺已充分压平贴附于载片上，则将其置于4%多聚甲醛（PFA）中，于4°C固定过夜。次日清晨，取下盖玻片，使整个胰腺在室温下充分暴露于PFA中继续固定6–8小时。若胰腺固定不充分，可延长PFA固定时间，必要时可再过夜。随后将载片转移至含1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）中，4°C孵育过夜。次日，将载片转移至饱和蔗糖溶液中处理1–2天。之后将载片转移至100%甘油中，直至组织完全透明，以获得最佳荧光信号分辨率；组织透明过程通常需要1–3天。（荧光信号可维持数周甚至数月，但为获得最佳成像效果，建议在组织透明后尽快进行成像。）
- 将胰腺保存在阴暗、低温环境中，以维持器官结构及其荧光信号的稳定性。
第2部分：完整胰腺中β细胞面积的成像与定量
- 使用镊子或戴手套的手将载玻片从盛有100%甘油的容器中取出。用乙醇仅擦拭盖玻片背面以去除多余的甘油，清洁后准备成像。
- 打开 StereoInvestigator 软件（MicroBrightField, Williston, VT），对于年龄超过3周的小鼠胰腺，使用2倍物镜在大号玻璃载片上成像；对于年龄小于3周的小鼠胰腺，将其压在两个25 mm盖玻片之间，使用10倍物镜成像。设置为实时成像模式（图像 → 实时成像）以观察图像。选择合适的曝光时间，以清晰显示GFP标记的β细胞。（曝光不足会遗漏较小的胰岛和β细胞，而曝光过度则会产生额外的假信号。）
- 在屏幕任意位置单击以建立参考点，然后围绕整个胰腺绘制轮廓。启动虚拟切片功能（图像 → 获取虚拟切片）。通过旋转调焦旋钮，在Z轴上确定并选择最佳焦平面，即可见且聚焦清晰的胰岛和β细胞数量最多的平面。选定后，StereoInvestigator 会自动捕获屏幕上显示的图像。利用电动载物台，虚拟切片功能将按顺序在所绘制轮廓内逐个捕获每个光学切面图像（图1A），然后将所有图像合并为一幅整合图像（图1B）。虚拟切片成像采用落射荧光配置（即宽场滤光片），使相机能够捕获特定深度内的所有信号，包括未完全聚焦的信号，因此最终的虚拟切片是一幅整合的二维图像，而非整个胰腺三维重建的最大投影。每个样本的平均虚拟切片扫描时间为30分钟，但较大的胰腺可能需要长达1小时。
- 保存图像后，使用ImageJ打开该图像并开始分析。当图像加载完成并在屏幕上显示后，打开并运行虚拟切片分析宏（补充材料1）。
- 按照宏提供的逐步说明进行操作。使用“魔棒”和“选择区域”工具去除由光散射造成的不必要伪影。检查并扣除图像中不必要的背景。使用“直线”工具测定最大胰岛的半径，以便后续的滚动球功能有效去除自发荧光和散射光。测试并选择最合适的“低阈值”，以捕获小胰岛和β细胞簇（<3×104 μm2）的荧光信号。测试并选择最合适的“高阈值”，以捕获胰岛的荧光信号。运行虚拟切片的定量分析，该分析将测量并生成胰岛面积、周长、圆形度和Feret直径的列表。
图1A 完整成年小鼠胰腺中β细胞全分布的虚拟切片图像分析
使用2倍物镜拍摄的10周龄雄性小鼠胰腺单个光学切片图像。图像包含所有胰岛的分布，甚至包括小型β细胞簇（<10个细胞）。
图1B 完整成年胰腺中β细胞分布的虚拟切片图像分析
一个统一的虚拟切片，右侧为背侧胰腺，左侧为腹侧胰腺。比例尺为5 mm。
代表性结果
熟练地制备用于虚拟切片成像的胰腺，可实现对整个胰腺中所有GFP标记的β细胞进行有效定量，并生成清晰且轮廓分明的胰岛的虚拟切片图像。成功地对完整胰腺进行原位（in situ）虚拟切片成像，不仅能够检测和定量β细胞以及单个和总体胰岛面积，还可分析胰岛大小分布、区域特征及生长模式。尽管ImageJ具备在虚拟切片图像分析中同时检测所有β细胞的能力，但也可通过限定胰岛大小（按面积或直径）或位置，控制需定量的β细胞范围。标准分析会排除小于单个β细胞的伪影（例如碎片）（<170 μm2），并对每个被识别的胰岛记录其面积、周长（围绕区域的边界距离）、圆形度（反映圆润程度，1.0表示完美圆形）以及Feret直径（区域内最长距离）。虚拟切片分析可通过应用Watershed分割算法增强虚拟切片图像，该算法可根据胰岛形状将重叠的胰岛区分开，形成独立的胰岛。分析过程进一步生成一系列详细图像，包括低强度和高强度下的图像掩膜（图1C）、所有推测胰岛的轮廓图（每个胰岛单独编号，并在对应信息表格中列出）（图1D），以及原始虚拟切片图像（图1B）。需注意，在选择阈值时可能引入潜在的技术偏差，例如将大结构周围多余的光信号纳入分析，或减少胰岛总数，尤其是微弱的小颗粒信号，从而影响胰岛定量结果。
图1c 完整成年胰腺中β细胞全分布的虚拟切片图像分析
虚拟切片中荧光颗粒的掩膜。颜色编码：[1] 蓝色：低强度荧光；[2] 绿色：中等强度荧光；[3] 红色：高强度荧光。
图1D 成年完整胰腺中β细胞全分布的虚拟切片图像分析
对单个胰岛/β细胞簇进行定量分析。请注意，每个胰岛（包括小的β细胞簇）均被编号，并在其对应的图表中详细列出相关信息。对每个结构测量了四个参数：（1）面积；（2）周长；（3）圆形度：表示圆形程度，数值1.0代表完美的圆形；（4）Feret直径：一个区域内最长的距离。注意，编号#706的结构仅包含少数几个β细胞，展示了分析的分辨率。Watershed分割法可识别相邻胰岛的群体（如图所示），并将其正确区分为独立的胰岛（胰岛1554、1555和1556）。
图1E 完整成年胰腺中β细胞全分布的虚拟切片图像分析
基于虚拟切片分析的三维图，坐标轴分别为面积、周长和Feret直径。每个点代表一个胰岛。
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讨论
对完整胰腺中胰岛及β细胞簇的虚拟切片图像进行分析，可提供胰岛整体分布的大尺度视图，从而能够研究并比较不同时期胰岛总分布的发育与变化。我们对胰岛形成过程的分析即为一个典型示例（1）。通过对新生小鼠胰腺在不同时间点（P1-P21）进行系统性分析发现，胰岛是通过分裂方式形成的。虽然在P1至P10阶段，β细胞增殖符合对数正态概率密度函数，但从P12开始，胰岛分布逐渐偏离对数正态模式，呈现左偏趋势，提示存在分裂过程。类似分析也应用于小鼠胰岛素瘤进展过程的研究，其数据符合具有峰值位置和x轴尺度参数的对数正态函数，以及幂律分布（2）：
P(x) = axy。数据以面积、周长和Feret直径的三维图形式有效呈现（图1E）。在本研究中，使用了转基因小鼠模型，其中胰腺β细胞在小鼠胰岛素I启动子（MIP）的调控下被绿色荧光蛋白（GFP；3, 4）基因标记。MI...
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致谢
本研究由美国公共卫生服务基金（DK-081527、DK-072473 和 DK-20595）资助芝加哥大学糖尿病研究与培训中心（动物模型核心），以及Kovler家族基金会的捐赠支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子 | Miltex Inc. | ||
| 剪刀 | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| 剪刀 | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| 大型载玻片 | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| 大型盖玻片 | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| 盖玻片 | Erie Scientific | 25mm 圆形 | |
| 荧光显微镜 | Olympus Corporation | ||
| 解剖显微镜 | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP 小鼠 | Jackson Laboratory |
参考文献
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
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重印与许可
