定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织和发育阶段mRNA水平的工具。本报告展示了利用qRT-PCR测定入侵性昆虫物种翡翠 ash 蛀虫（emerald ash borer）不同幼虫组织和发育阶段mRNA水平的方法。
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本文内容
摘要
摘要
翡翠灰粉甲虫（EAB，Agrilus planipennis) 是一种外来入侵性害虫，已导致数百万棵白蜡树（Fraxinusspp）在北美洲。 EAB 仍在迅速扩散，攻击从幼苗到成熟树木等不同年龄的 ash 树。然而，迄今为止，关于 EAB 的分子层面知识极为有限或几乎空白。我们致力于解析在组织水平上支持 EAB 成功定殖 ash 树的基于分子的生理过程。在本报告中，我们展示了利用定量实时 PCR（qRT-PCR）有效测定不同幼虫组织（包括中肠、脂肪体和表皮）以及不同发育阶段（包括 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-龄幼虫、蛹前期和成虫）的EAB。例如，一个围食膜蛋白基因（本文命名为，AP-PERI1) 以目的基因为例，核糖体蛋白（AP-RP1) 作为内参对照。围食膜蛋白（Peritrophins）是围食膜/基质（peritrophic membrane/matrix, PM）的重要组成成分，而围食膜是昆虫肠道的内衬结构。PM 具有多种功能，包括参与消化过程以及为中肠上皮提供机械保护。
方案
包含不同步骤的完整方案如图1中的流程图所示。以下详细说明构成解剖、RNA提取、第一链cDNA合成和qRT-PCR的各个步骤。
一、幼虫解剖
- 在开始本操作之前，将 Emerald ash borer（EAB）幼虫置于湿润的滤纸上，直至进行解剖。将新配制的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上，以确保整个解剖过程中缓冲液保持低温。
- 首先，用精细解剖针将 EAB 幼虫固定在解剖板上，然后向解剖板中加入低温的 1× PBS 缓冲液。
- 第一步，使用精细解剖剪将幼虫头部剪除；随后去除幼虫的最后一个腹节。
- 使用钟表匠镊子从幼虫尸体上轻轻提起表皮，然后用剪刀沿尸体纵轴剪开切口。操作时需注意避免切破肠道。
- 小心地将中肠组织与其他组织（如脂肪体和结缔组织）分离。随后用新鲜的 1× PBS 缓冲液冲洗组织，确保无脂肪体残留。将分离出的中肠组织转移至含有 500 μL 预冷 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。
- 接下来，用镊子分离脂肪体组织，并将其转移至含有 500 μL 冷却 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。
- 最后，通过刮除附着的其他组织，从幼虫尸体上分离表皮组织，注意避免破坏组织完整性。用新鲜 PBS 缓冲液冲洗分离的表皮组织，然后将其转移至含有 500 μL 冷却 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。
- 分离得到的脂肪体、表皮和中肠组织可在 -80 °C 下保存，直至进行 RNA 提取。
- 为进行 RNA 提取，根据 EAB 样本的发育阶段进行分类。这些阶段包括 1 龄、2 龄、3 龄和 4 龄幼虫、前蛹期以及成虫期。
II. RNA 提取（按照 Trizol 试剂说明书操作）
匀浆
- 开始RNA提取时，首先使用塑料研杵在含有1 mL Trizol的1.5 mL离心管中匀浆组织。匀浆后，用Trizol试剂将每个样品的总体积调至1 mL。
- 对于发育阶段的样品，先在液氮中用研钵和研杵将整个动物组织匀浆，然后取匀浆液等分试样（50 μg）加入1 mL Trizol中。
相分离：
- 将样本管在室温下用 1 mL Trizol 孵育 15 分钟。
- 孵育结束后，向每根管中加入 200 μL 氯仿。加入氯仿后立即剧烈振荡试管约 15 秒，随后在室温下再孵育 2–3 分钟。
- 接着，在 2 °C 条件下以 12,000×g 离心 15 分钟。离心后，RNA 位于水相中，水相体积应为 600 μL，即 Trizol 总体积的 60%。
RNA 沉淀
- 小心地仅移取水相。若含有水相以下的物质，将导致提取的 RNA 被污染。然后，将水相转移至适当标记的 1.5 mL 离心管中。
- 为使 RNA 从水相中沉淀析出，向每根离心管中加入 0.5 mL 异丙醇。样品于室温孵育 10 分钟。孵育结束后，在 2°C 条件下以 12,000×g 离心 10 分钟。
RNA 洗涤
- 离心后，弃去管中的上清液。RNA存在于试管底部形成的凝胶状沉淀中。用75%乙醇洗涤沉淀，每1 mL Trizol加入至少1 mL 75%乙醇。涡旋振荡混匀。然后，在2 °C下以7500×g离心5分钟。
RNA 洗脱
- 弃去各管中的上清液。将离心管再次放入小型台式离心机中，离心1分钟。用移液器小心吸除管中残留的过量上清液。打开管盖，使沉淀在空气中干燥5–10分钟。注意避免过度干燥沉淀，否则将显著降低其溶解度。
- 空气干燥后，将沉淀重悬于 焦碳酸二乙酯，或经DEPC处理的水。用于重悬沉淀的水量取决于沉淀的大小。使用 50 μL 少量沉淀用DEPC处理水 100 μL 对于较大的沉淀物，通过反复上下移动移液器吸头，使沉淀物在经DEPC处理的水中完全溶解。
- 一旦沉淀溶解，将样品置于 55 °C 10分钟。
- 然后，使用 Nanodrop 分光光度计测量每个 RNA 样本的浓度（2 μL RNA 样本的
- 将RNA样品储存在-80°C 直至进一步使用。
III. 第一链 cDNA 合成（按照 Invitrogen 公司 SuperScript 第一链合成试剂盒的说明书操作）
- 对于每个RNA样本，在PCR管中加入以下成分：
RNA x μl 10 mM dNTP 混合液 M 1μl Oligo(dt)0.5 μg/ μl) 1 μl DEPC 处理水 (8-x) μl 总体积： 10 μl 注意：x 是用于 cDNA 合成的 RNA 体积。根据 RNA 的浓度，2-3 μg 每次反应将使用指定量的 RNA，每个反应的总体积应为 10 μl. - 将上述反应混合物置于热循环仪中 65°C 4 分钟。
- 从热循环仪中取出试管，立即置于冰上至少 2 分钟。
- 通过添加以下成分来制备第一链主混合液：
10X RT缓冲液 2μl 25 mM MgCl2 4 μl 0.1 M DTT 2 μl RNase 去除剂 1 μl - 添加 9 μl 向含有RNA样本的各管中加入主混合液，用移液器吹打混匀，并短暂离心。
- 将试管重新放回热循环仪中，在指定温度下孵育2分钟 42°C.
- 暂停热循环仪并添加 1 μl 加入 Superscript II 逆转录酶（Invitrogen）至各管中。此步骤应迅速完成。
- 将样品在指定条件下孵育 42°C 1.5 小时。
- 终止反应于 70°C 15分钟。
- 从热循环仪中取出试管，置于冰上。
- 添加 1 μl 向每管中加入 RNase H，并将各管重新放回热循环仪中 37°C 20分钟。
- 从热循环仪中取出样本后，加入 20 μl 每管中加入无核酸酶水。此步骤中，每个样品的体积加倍。
- 使用以下方法检测每个样品的浓度 2 μl 样品的浓度。取每个样品的等分试样，使其浓度为20 ng/μl 用于qRT-PCR。加水至样品浓度为20 ng/μL所需的水量μl 将取决于合成的 cDNA 的初始浓度。
IV. qRT-PCR：
引物设计与参考基因的确定
- 设计引物，其熔解温度（Tm）为 60°C，扩增产物大小约为 100 bp。
- 本实验以 AP-PERI1 作为目的基因。后续数据分析与归一化需使用参考基因或内参基因。本实验采用核糖体蛋白基因（AP-RP1）作为参考基因。
- 配制所用引物（包括参考基因引物）的 5 µM 工作液。
标准品的制备
- 为计算所用引物的扩增效率，应制备标准品。
- 将待检测的不同样品的 cDNA 混合。
- 对标准曲线中每个设定的检测点进行 5 倍系列稀释。通常四个稀释点已足够，但强烈推荐使用五个稀释点。
- 所需体积取决于检测点数量和技术重复次数。应确保有足够的体积为每个待测基因（包括参照基因）制备标准品。
培养板模板
- 为qRT-PCR板中的每个孔设计一个标明样品名称的模板。请记得为每个基因设置标准品，并为每个样品设置至少两个技术重复。
设置循环参数
- 打开定量反转录 PCR 仪并输入循环参数。本实验的循环参数如下：
步骤 1：- 1 个循环：95°C 3 分钟
- 40 个循环：95°C 15 秒，随后 60°C 30 秒
（可选：如需测定熔解曲线，请包含以下步骤）
- 1 个循环：95°C 1 分钟
- 1 个循环：55°C 1 分钟
- 81 个循环：55°C 30 秒
CFX96（BioRad）仪器的板设置
- 为每个基因（包括内参基因）在单独的离心管中配制预混液。每孔的预混液体积组成如下：
无核酸酶水 2μl 2.5 X SYBR green 4 μl 上游引物 1 μl 下游引物 1 μl 总体积 8 μl - 配制预混液时，应额外增加1-2个反应量，以补偿移液过程中的误差。
- 根据预先设计的模板，向每个孔中加入2 μL（20 ng/μL）的cDNA。然后向每孔加入8 μL预混液，使每个反应的总体积达到10 μL。
- 上下吹打2-3次，确保样品充分混匀。检查移液枪尖端无残留液体。为避免交叉污染，每个样品必须使用新的枪头。
- 待整块板加样完成后，用光学封板膜密封。避免用手接触封板膜，以免油脂影响检测结果。随后将板在500 rpm条件下离心1分钟，确保各孔中的反应液全部沉降至孔底。
- 离心后，检查板底部是否无冰或水珠。最后将板放入qRT-PCR仪中，运行PCR程序。
五、实验示意图
图1：展示基因表达研究各步骤顺序的流程图。
图 2：A）幼虫EAB解剖图，显示中肠位于中央。B）分离的幼虫EAB中肠
图3： A) 围食膜蛋白基因（AP-PERI1）在不同幼虫组织（包括表皮（Cu）、中肠（MG）和脂肪体（FB））中的平均相对表达值（REVs）。以一种专属于翡翠灰螟的核糖体蛋白（本文命名为AP-RP1）作为内参，用于标准化目标基因AP-PERI1的表达数据。B) AP-PERI1在幼虫组织中的相对倍数变化。表皮组织的表达量最低，因此被选作校准样本（1X）（Pfaffl, 2001）。
图 4：A) 不同发育阶段的翡翠灰螟（EAB）中一个围食膜蛋白基因（AP-PERI1）的平均相对表达值（REVs），包括幼虫各龄期（1龄、2龄、3龄和4龄）、前蛹（PP）及成虫（A）。使用EAB特异性的核糖体蛋白基因（AP-RP1）作为内参，对目标基因 AP-PERI1 的数据进行标准化。B) AP-PERI1 在不同发育阶段的相对倍数变化。前蛹（PP）样本的mRNA水平最低，因此被选为校准样本（1X样本）。
六、结论
定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织及发育阶段mRNA水平的工具。此外，qRT-PCR也一直是验证高通量基因表达分析（如微阵列和新一代RNA-Seq）所产生数据的关键方法。
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讨论
通过qRT-PCR板获得每个样本的循环阈值（Ct）值。为绘制标准曲线，将各稀释度所获得的Ct值对其浓度的对数作图。然后将实验样本的Ct值投射到该稀释系列的标准曲线上。目标物的量值通过为每次实验（即组织表达和发育阶段表达）单独生成的标准曲线计算得出。相对表达值（REVs）通过将目标序列（本例中为AP-PERI1）的量除以内参基因（AP-RP1）的量得到。为进行显著性分析，采用SAS软件（SAS Institute Inc. SAS/STAT 用户指南，版本9.1）中的PROC MIXED过程，对每个基因的REV对数值进行方差分析（ANOVA）。表达水平的显著性定义为p < 0.05。 在组织表达分析中，相对倍数变化以表皮样本作为校准样本（1X样本，Pfaffl, 2001），因此中肠和脂肪体中的表达水平均相对于表皮进行计算。在发育表达分析中，以预蛹样本作为校准样本。两项研究均使用了两个生物学重复和三个技术重复。
我们的实验显示，与所检测的其他组织相比，中肠组织中的AP-PERI1转录本水平显著更...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢俄亥俄州立大学/俄亥俄农业研究与发展中心（OARDC，美国俄亥俄州伍斯特）昆虫学系的 Lourdes Delta Arrueta Antequera 在实验设计方面提供的帮助。感谢美国农业部林务局北方研究站（USDA, Forest Services, NRS）的 Therese Poland 博士提供 emerald ash borer（EAB）幼虫样本。感谢 Luis A Canas 博士和 Nuris M Acosta 在显微镜设备设置方面提供的协助。本项目经费由拨付给俄亥俄农业研究与发展中心及俄亥俄州立大学的州级和联邦资金提供支持。
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参考文献
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重印与许可
