利用实时荧光定量PCR分析翡翠灰螟（Agrilus planipennis）中的基因表达

摘要

定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织和发育阶段mRNA水平的工具。本报告展示了利用qRT-PCR测定入侵性昆虫物种翡翠 ash 蛀虫（emerald ash borer）不同幼虫组织和发育阶段mRNA水平的方法。

摘要

翡翠灰粉甲虫（EAB，Agrilus planipennis) 是一种外来入侵性害虫，已导致数百万棵白蜡树（Fraxinusspp）在北美洲。 EAB 仍在迅速扩散，攻击从幼苗到成熟树木等不同年龄的 ash 树。然而，迄今为止，关于 EAB 的分子层面知识极为有限或几乎空白。我们致力于解析在组织水平上支持 EAB 成功定殖 ash 树的基于分子的生理过程。在本报告中，我们展示了利用定量实时 PCR（qRT-PCR）有效测定不同幼虫组织（包括中肠、脂肪体和表皮）以及不同发育阶段（包括 1^st-, 2^nd-, 3^rd-, 4^th-龄幼虫、蛹前期和成虫）的EAB。例如，一个围食膜蛋白基因（本文命名为，AP-PERI1) 以目的基因为例，核糖体蛋白（AP-RP1) 作为内参对照。围食膜蛋白（Peritrophins）是围食膜/基质（peritrophic membrane/matrix, PM）的重要组成成分，而围食膜是昆虫肠道的内衬结构。PM 具有多种功能，包括参与消化过程以及为中肠上皮提供机械保护。

方案

包含不同步骤的完整方案如图1中的流程图所示。以下详细说明构成解剖、RNA提取、第一链cDNA合成和qRT-PCR的各个步骤。

一、幼虫解剖

1. 在开始本操作前，将 Emerald ash borer（EAB）幼虫置于湿润的滤纸上，直至进行解剖。将新配制的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上，以确保整个解剖过程中缓冲液保持低温。
2. 首先，用精细解剖针将 EAB 幼虫固定在解剖板上，然后向解剖板中加入低温的 1× PBS。
3. 首先使用精细解剖剪将幼虫头部剪除，随后去除幼虫的最后一个腹节。
4. 使用钟表匠镊子轻轻提起幼虫尸体上的表皮组织，然后用剪刀沿尸体纵轴剪开。注意在剪开过程中避免刺破肠道。
5. 小心地将中肠组织与其他组织（如脂肪体和结缔组织）分离。随后用新鲜的 1× PBS 缓冲液冲洗组织，确保无脂肪体污染。将分离出的中肠组织转移至含有 500 μL 预冷 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。
6. 接下来，使用镊子分离脂肪体组织，并将其转移至含有 500 μL 冷却 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。
7. 最后，通过刮除附着的其他组织，从幼虫尸体上分离表皮组织，注意避免破坏组织完整性。用新鲜 PBS 缓冲液冲洗分离的表皮组织，然后将其转移至含有 500 μL 冷却 Trizol 试剂的 1.5 mL 离心管中。
8. 分离得到的脂肪体、表皮和中肠组织可在 -80 °C 下保存，直至进行 RNA 提取。
9. 在准备 RNA 提取前，根据 EAB 样本的发育阶段进行分类。这些阶段包括 1 龄、2 龄、3 龄和 4 龄幼虫、前蛹以及成虫。

II. RNA 提取（按照 Trizol 试剂说明书操作）

匀浆

1. 开始RNA提取时，首先使用塑料研钵将组织在含有Trizol的1.5 mL离心管中进行匀浆。匀浆后，用Trizol试剂将每个样品的总体积调至1 mL。
2. 对于发育阶段的样品，先在液氮中用研钵和研杵将整个动物组织研磨匀浆，然后取一定量的匀浆液（50 μg）加入1 mL Trizol中。

相分离：

3. 将样本管与1 mL Trizol在室温下孵育15分钟。
4. 孵育结束后，向每根试管中加入200 μL氯仿。加入氯仿后立即剧烈振荡试管约15秒。然后在室温下再孵育2–3分钟。
5. 接下来，在2 °C条件下以12,000×g离心15分钟。离心后，RNA位于水相中。水相体积应为600 μL，约为Trizol总体积的60%。

RNA 沉淀

6. 小心地仅移取水相。若含有水相以下的物质，将导致提取的RNA被污染。随后，将水相转移至适当标记的1.5 mL离心管中。
7. 为从水相中沉淀RNA，向每根离心管中加入0.5 mL异丙醇。室温孵育10分钟。孵育结束后，在2°C条件下以12,000×g离心10分钟。

RNA 洗涤

8. 离心后，弃去管中的上清液。RNA存在于试管底部形成的凝胶状沉淀中。用75%乙醇洗涤沉淀，每1 mL Trizol加入至少1 mL 75%乙醇。涡旋混匀。然后，在2 °C下以7500×g离心5分钟。

RNA 洗脱

9. 弃去离心管中的上清液。将离心管再次放入小型台式离心机中，离心1分钟。用移液器小心吸除管内残留的多余上清液。打开管盖，让沉淀在空气中干燥5–10分钟。注意不要过度干燥沉淀，以免显著降低其溶解度。
10. 空气干燥后，用焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）处理水重悬沉淀。重悬所用的水量取决于沉淀的大小：小沉淀使用50 μL DEPC处理水，大沉淀使用100 μL。通过反复上下吹打移液器枪头，使沉淀完全溶解于DEPC处理水中。
11. 待沉淀完全溶解后，将样品置于55 °C条件下孵育10分钟。
12. 随后，使用Nanodrop分光光度计测定各RNA样品的浓度（取2 μL RNA样品进行检测）。
13. 将RNA样品储存于-80°C，待后续使用。

III. 第一链 cDNA 合成（按照生产商说明书使用 Invitrogen 的 SuperScript 第一链合成试剂盒）

1. 每个 RNA 样本在 PCR 管中加入以下成分：

   RNA	x μl
   10 mM dNTP 混合物	1 μl
   Oligo(dt) (0.5 μg/μl)	1 μl
   DEPC 处理水	(8-x) μl
   总体积：	10 μl
   注：x 是用于 cDNA 合成的 RNA 体积。根据 RNA 浓度，每个反应使用 2–3 μg RNA，每个反应的总体积应为 10 μl。

2. 将上述反应混合物置于热循环仪中，65°C 反应 4 分钟。
3. 从热循环仪中取出试管，立即置于冰上至少 2 分钟。
4. 通过加入以下成分配制第一链 cDNA 合成主混合液：

   10× RT 缓冲液	2 μl
   25 mM MgCl2	4 μl
   0.1 M DTT	2 μl
   RNase 抑制剂	1 μl

5. 向含有 RNA 样本的每根试管中加入 9 μl 主混合液，用移液器混匀后短暂离心。
6. 将试管重新放入热循环仪，42°C 孵育 2 分钟。
7. 暂停热循环仪，向每根试管中加入 1 μl Superscript II 反转录酶（Invitrogen），此步骤应迅速完成。
8. 在 42°C 下孵育样品 1.5 小时。
9. 在 70°C 下反应 15 分钟以终止反应。
10. 从热循环仪中取出试管，置于冰上。
11. 向每根试管中加入 1 μl RNase H，并将试管重新放入热循环仪，在 37°C 下孵育 20 分钟。
12. 从热循环仪中取出样品后，向每根试管中加入 20 μl 无核酸酶水。此步骤使各样品体积加倍。
13. 取 2 μl 样品检测每个样本的浓度。对各样品进行分装，调整浓度至 20 ng/μl 用于 qRT-PCR。加水量需根据合成的 cDNA 初始浓度确定，以达到 20 ng/μl 的终浓度。

IV. qRT-PCR：

引物设计与参考基因的确定

1. 设计引物，其熔解温度（Tm）为 60°C，扩增产物大小约为 100 bp。
2. 本实验中以 AP-PERI1 作为目的基因。后续数据分析与数据归一化需要使用参考基因或内参基因。本实验采用核糖体蛋白基因（AP-RP1）作为参考基因。
3. 制备将要使用的引物（包括参考基因引物）的 5 µM 工作液。

标准品的制备

4. 为了计算所用引物的扩增效率，应制备标准品。
5. 将待检测的不同样品的 cDNA 混合。
6. 为标准曲线中每个设定的点进行 5 倍梯度稀释。通常四个稀释点已足够，但强烈建议使用五个稀释点。
7. 所需体积取决于标准曲线的点数以及技术重复的次数。应确保有足够的体积为每个待测基因（包括参考基因）制备标准品。

板模板

8. 设计一个模板，标明qRT-PCR板中每个孔的样品名称。请记得为每个基因设置标准品，并为每个样品设置至少两个技术重复。

设置循环参数

9. 打开定量反转录PCR仪并输入循环参数。本实验的循环参数如下：
   步骤1：
   • 1个循环：95°C 3分钟
   步骤2：
   • 40个循环：95°C 15秒，随后60°C 30秒
     （可选：若需测定熔解曲线，则包含以下步骤）
   步骤3：
   • 1个循环：95°C 1分钟
   步骤4：
   • 1个循环：55°C 1分钟
   步骤5：
   • 81个循环：55°C 30秒

CFX96（BioRad）仪器的板设置

11. 为每个基因（包括参照基因）在单独的离心管中配制预混液。每孔的预混液组分如下：

    无核酸酶水	2μl
    2.5 X SYBR Green	4 μl
    上游引物	1 μl
    下游引物	1 μl
    总体积	8 μl

12. 配制预混液时，应额外增加1-2个反应量，以补偿移液误差。
13. 根据先前设计的模板，向每个孔中加入2 μL（20 ng/μL）cDNA。然后向每孔加入8 μL预混液，使每个反应的总体积为10 μL。
14. 上下吹打2-3次，确保样品充分混匀。检查移液枪尖端无残留液体。为避免交叉污染，每个样品必须使用新的枪头。
15. 待整块板加样完成后，用光学封板膜覆盖。避免用手直接接触封板膜，以免油脂影响检测结果。随后将PCR板在500 rpm条件下离心1分钟，确保各孔中的反应液全部沉降至孔底。
16. 离心后，检查PCR板底部是否存有冰晶或水珠。最后将PCR板放入qRT-PCR仪中，运行PCR程序。

实验的图解表示

图1： 基因表达研究中各步骤顺序的流程图。

图2：A）幼虫期翡翠灰螟解剖图，显示中肠位于中央。B）幼虫期翡翠灰螟分离出的中肠

图3： A) 围食膜蛋白基因（AP-PERI1）在不同幼虫组织中的平均相对表达值（REVs），包括表皮（Cu）、中肠（MG）和脂肪体（FB）。使用一种翡翠灰螟特异性的核糖体蛋白基因（本文命名为 AP-RP1）作为内参，对目标基因 AP-PERI1 的数据进行标准化。B) AP-PERI1 在幼虫组织中的相对表达倍数变化。表皮组织的表达量最低，因此被选作校准样本（1X）（Pfaffl, 2001）。

图4： A) 不同发育阶段翡翠灰螟（EAB）中围食膜蛋白基因（AP-PERI1）的平均相对表达值（REVs），包括幼虫各龄期（1龄、2龄、3龄和4龄）、前蛹（PP）及成虫（A）。以翡翠灰螟特异性的核糖体蛋白基因（AP-RP1）作为内参，用于标准化目标基因 AP-PERI1 的表达数据。B) AP-PERI1 在不同发育阶段的相对表达倍数变化。前蛹样本的mRNA水平最低，因此被选为校准样本（1X样本）。

六、结论

定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织及发育阶段mRNA水平的工具。此外，qRT-PCR主要被用作验证高通量基因表达分析（如微阵列和新一代RNA-Seq）所产生的数据的关键手段。

讨论

通过qRT-PCR板获得每个样本的循环阈值（Ct）值。为绘制标准曲线，将各稀释度所获得的Ct值对其浓度的对数作图。然后将实验样本的Ct值投射到该稀释系列的标准曲线上。目标物的量值通过为每次实验（即组织表达和发育阶段表达）单独生成的标准曲线计算得出。相对表达值（REVs）通过将目标序列（本例中为AP-PERI1）的量除以内参基因（AP-RP1）的量得到。为进行显著性分析，采用SAS软件（SAS Institute Inc. SAS/STAT 用户指南，版本9.1）中的PROC MIXED过程，对每个基因的REV对数值进行方差分析（ANOVA）。表达水平的显著性定义为p < 0.05。 在组织表达分析中，相对倍数变化以表皮样本作为校准样本（1X样本，Pfaffl, 2001），因此中肠和脂肪体中的表达水平均相对于表皮进行计算。在发育表达分析中，以预蛹样本作为校准样本。两项研究均使用了两个生物学重复和三个技术重复。

我们的实验显示，与所检测的其他组织相比，中肠组织中的AP-PERI1转录本水平显著更...