斑马鱼后脑中细胞的标记与成像

摘要

理解塑造早期胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。本文介绍一种在完整斑马鱼胚胎中利用膜定位的绿色荧光蛋白对单个细胞或少量细胞簇进行标记的技术。

摘要

理解塑造早期脊椎动物胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。在斑马鱼胚胎中，质粒DNA的注射会导致嵌合表达，从而实现单个细胞或少量细胞簇的可视化。¹我们描述了如何通过注射质粒DNA来标记细胞膜定位的绿色荧光蛋白（mGFP），该质粒在泛表达启动子的调控下，可用于成像神经管形成过程中的细胞。本实验方案的核心在于高分辨率成像标记细胞的方法，既可在切片中进行，也可实现实时成像。该方案包括将mGFP DNA注射到年轻的斑马鱼胚胎中，随后对胚胎进行振动切片、抗体标记，并使用共聚焦显微镜成像。 Alternatively，表达mGFP的活体胚胎也可通过延时共聚焦显微镜进行成像。我们此前已利用这一简便的方法分析了驱动斑马鱼胚胎后脑区域神经管形成的细胞行为。²固定的样本制备实现了对神经管中细胞形态和组织结构的前所未有的可视化观察，而活体成像则补充了这一方法，有助于更深入地理解神经管形成过程中发生的细胞动态变化。

方案

1. 显微注射

1. 将编码膜定位绿色荧光蛋白（mGFP，Richard Harland 惠赠）的质粒稀释至浓度为 40 ng/ml。通过使用 Qiagen Maxi Prep Kit 纯化质粒（mGFP/PCS2+，Richard Harland 惠赠）并线性化制备 DNA。建议向溶液中加入酚红（稀释至总体积的 1/10），以便观察溶液。将 DNA 溶液置于冰上保存。
2. 在体视显微镜下，将注射针（Narishinge Scientific 生产的 90mm 玻璃毛细管；货号 NA-GD-1）对准带刻度的载玻片进行校准，并用干净的刀片轻轻敲击针管直径为 1μm 的位置，以获得合适大小的针尖。
3. 为校准针头以注入已知体积（2nl），将针头连接至显微注射装置（PCI 100 Microinjector；Harvard Apparatus），并用移液器从前端填充 0.5μl 含酚红和水的溶液至石蜡片上的液滴中。可通过脚踏开关控制溶液的释放。将压力设定为 7 KPa，并调节时间（10msec 至 30msec），使释放 0.5μl 溶液需踩下 250 次脚踏。
4. 将已校准的针头小心地放置在湿润的 100 mm 培养皿中的石蜡条上。为保持湿度，在培养皿边缘放置湿润的 Kimwipes（以防止针头内溶液蒸发）。
5. 使用微量移液器将 0.5–1μl DNA 溶液从针头末端（未校准端）装入针中。
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讨论

综上所述，本文所述的标记技术可实现对斑马鱼胚胎形态发生过程的单细胞分析。本实验方案主要侧重于在泛表达启动子调控下，利用mGFP对神经管中标记细胞进行成像的方法。关于该瞬时表达检测的其他应用，读者可参考Andersen et al.³近期发表的一篇论文。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液
Hank's 储存液 #1：8.0 g NaCl，0.4 g KCl 溶于 100 ml dd H2O Hank's 储存液 #2：0.358 g Na2HPO4 无水，0.60 g KH2PO4 溶于 100 ml ddH2O Hank's 储存液 #4：0.72 g CaCl2 溶于 50 ml ddH2O Hank's 储存液 #5：1.23 g MgSO4·7H2O 溶于 50 ml dd H2O 1 × 磷酸盐缓冲液：0.8% NaCl，0.02% KCl，0.02 M PO4，pH 7.3 封闭液：2% 正常山羊血清，1% 牛血清白蛋白（BSA），1% 二甲基亚砜（DMSO）