理解塑造早期胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。本文介绍一种在完整斑马鱼胚胎中利用膜定位的绿色荧光蛋白对单个细胞或少量细胞簇进行标记的技术。
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摘要
摘要
理解塑造早期脊椎动物胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。在斑马鱼胚胎中，质粒DNA的注射会导致嵌合表达，从而实现单个细胞或少量细胞簇的可视化。1我们描述了如何通过注射质粒DNA来标记细胞膜定位的绿色荧光蛋白（mGFP），该质粒在泛表达启动子的调控下，可用于成像神经管形成过程中的细胞。本实验方案的核心在于高分辨率成像标记细胞的方法，既可在切片中进行，也可实现实时成像。该方案包括将mGFP DNA注射到年轻的斑马鱼胚胎中，随后对胚胎进行振动切片、抗体标记，并使用共聚焦显微镜成像。 Alternatively，表达mGFP的活体胚胎也可通过延时共聚焦显微镜进行成像。我们此前已利用这一简便的方法分析了驱动斑马鱼胚胎后脑区域神经管形成的细胞行为。2固定的样本制备实现了对神经管中细胞形态和组织结构的前所未有的可视化观察，而活体成像则补充了这一方法，有助于更深入地理解神经管形成过程中发生的细胞动态变化。
方案
1. 显微注射
- 将编码膜定位绿色荧光蛋白（mGFP，Richard Harland 惠赠）的质粒稀释至浓度为 40 ng/ml。通过使用 Qiagen Maxi Prep Kit 纯化质粒（mGFP/PCS2+，Richard Harland 惠赠）并线性化制备 DNA。建议向溶液中加入酚红（稀释至总体积的 1/10），以便观察溶液。将 DNA 溶液置于冰上保存。
- 在体视显微镜下，将注射针（Narishinge Scientific 生产的 90mm 玻璃毛细管；货号 NA-GD-1）对准带刻度的载玻片进行校准，并用干净的刀片轻轻敲击针管直径为 1μm 的位置，以获得合适大小的针尖。
- 为校准针头以注入已知体积（2nl），将针头连接至显微注射装置（PCI 100 Microinjector；Harvard Apparatus），并用移液器从前端填充 0.5μl 含酚红和水的溶液至石蜡片上的液滴中。可通过脚踏开关控制溶液的释放。将压力设定为 7 KPa，并调节时间（10msec 至 30msec），使释放 0.5μl 溶液需踩下 250 次脚踏。
- 将已校准的针头小心地放置在湿润的 100 mm 培养皿中的石蜡条上。为保持湿度，在培养皿边缘放置湿润的 Kimwipes（以防止针头内溶液蒸发）。
- 使用微量移液器将 0.5–1μl DNA 溶液从针头末端（未校准端）装入针中。
- 当溶液到达针尖后，将用于装液的针头末端连接至显微注射装置。调节显微注射仪的参数，通过脚踏开关控制每次注射约 2 nl。
- 接下来，将斑马鱼胚胎置于含有胚胎培养基（1.0 ml Hank's Stock #1，0.1 ml Hank's Stock #2，1.0 ml Hank's Stock #4，95.9 ml ddH2O，1.0 ml Hank's Stock #5，1.0 ml 新鲜配制的 Hank's Stock #6，加入约 10 滴 1 M NaOH 调节 pH 至 7.2）的培养皿中央。
- 当胚胎发育至所需阶段时，用精细镊子轻轻夹住卵膜，并将针头插入预定注射区域。为实现广泛的 mGFP 表达，可在 1 细胞期将 DNA 注射至卵黄或细胞质中；若需限制 mGFP 表达于较小区域，则可在 4 细胞期（或更多细胞期）将 DNA 注射至单个细胞的细胞质中。
- 踩下显微注射装置的脚踏开关，注入约 2 nl 溶液，并确保因添加酚红而可见的溶液被正确注入。
- 小心地将针头从胚胎中取出。
- 对培养皿中的所有胚胎重复上述操作。
- 将胚胎在 28.5°C 下继续培养至所需发育阶段。
- 使用精细镊子轻轻剥离卵膜以去除胚胎的卵膜（若胚胎小于 24 hpf，在玻璃培养皿中去卵膜可提高胚胎存活率）。
- 用玻璃移液器从培养皿中移除空的卵膜。
2. 成像标记mGFP的振动切片
- 使用玻璃移液管将胚胎转移至固定液（4% 多聚甲醛溶于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS））中。在 4°C 过夜。
- 用1×PBS清洗胚胎，每次5分钟，共清洗3次。
- 将胚胎置于培养皿中，使用精细镊子去除卵黄，注意不要损伤胚胎。尽可能彻底地清除卵黄。
- 制备4%低熔点琼脂糖溶于H2O.
- 将熔化的琼脂糖放入塑料切片模具中。
- 用精细镊子将已注射的胚胎从培养皿中提起，并放置于琼脂糖中进行定位和方向调整。胚胎应置于模具的一端。
- 琼脂糖凝固后，使用平整的工具（如刮铲）将琼脂糖块从模具中取出。
- 用剃刀刀片将琼脂糖块的底端切齐，使其平整。
- 在振动切片机载物台上滴加一滴超级胶水，将琼脂糖块放置其上（琼脂糖块中曾用剃刀修平的一侧应朝向胶水）。若需切片多个胚胎，可将多个包埋于琼脂糖中的样本依次固定在载物台上。
- 将振动切片机切片台连接至振动切片机（Vibratome, Inc.）。
- 设置振动切片机的参数（常用设置：速度-3；厚度-50μm）若对多个胚胎进行切片，需将琼脂糖块在载物台上对齐，确保刀片切过整个胚胎，但不切透琼脂糖块的整个宽度（以便同一胚胎对应的切片保持在一起）。
- 在振动切片机工作台上加入1×PBS。
- 部分。
- 胚胎切片完成后，从振动切片机载物台上取下琼脂糖块。
- 用刀片小心地从琼脂糖块的背面切割，将各部分仔细分离。
- 使用精细镊子选取所需组织切片，并放入盛有1X PBS的多孔培养皿中（不同胚胎对应的切片应置于不同孔中）。
- 对每个胚胎重复上述操作。
- 继续进行抗体标记（步骤19至23），以增强mGFP成像效果（若切片在制备后一至两天内成像，则此步骤可能非必需）。
- 在室温下用1X PBS中的封闭液孵育切片30分钟，以阻断非特异性结合。
- 在摇床上，用封闭液按1:200稀释的一抗（rabbit a-GFP，Invitrogen 货号 A11122）孵育切片，室温孵育5小时或4℃过夜 4°C.
- 用 1% BSA/1×PBS/1% DMSO 溶液洗涤四次（每次分别为 10 分钟、15 分钟、30 分钟和 60 分钟）。
- 在室温下用适当的二抗封闭液孵育5小时，或在4℃过夜孵育 4°C.
- 用1% BSA/1×PBS/1% DMSO溶液洗涤四次，每次分别为10 min、15 min、30 min和60 min。
- 用 DAPI（50 ml 1×PBS 中含 0.1% DAPI；Invitrogen 货号 D1306）孵育切片 30 分钟，以染色细胞核。
- 用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。
- 载玻片上封片。
- 使用共聚焦显微镜成像。
3. 活体成像
- 在胚胎到达目标发育阶段前30分钟，去除活体已注射胚胎的卵膜。将胚胎置于麻醉溶液（0.01% 三卡因溶于胚胎培养液）中15分钟。
- 在35 mm玻璃底培养皿（MatTek；货号 P35G-o-20-C）上滴加一滴1%琼脂糖。
- 让琼脂糖自然凝固。
- 将毛细管在火焰上加热，用于在琼脂糖中打三个孔（也可使用其他物品如移液器吸头打孔）。确保孔底无残留琼脂糖。
- 用胚胎培养液填充培养皿。
- 使用玻璃移液器将胚胎放入孔中。
- 接着，用精细镊子调整胚胎方向，使待成像区域（头部背侧）与玻璃表面接触。
- 小心将培养皿转移至显微镜载物台上（盖上培养皿盖以防止蒸发）。
- 成像过程中，确保胚胎保持在28.5°C。
4. 结果
本文介绍了一种利用嵌合表达对斑马鱼神经管中单个细胞进行成像的简便方法。尽管斑马鱼胚胎具有光学透明性，但我们发现，使用振动切片机（vibratome）制备的横切面样本可显著增强神经细胞的可视化效果。这些切片较厚（50 mm），可在共聚焦显微镜下通过不同焦平面成像，从而完整观察特定细胞的细胞突起延伸情况。采用该方法所得结果已在其他文献中发表2，本文提供了野生型（WT）胚胎（图1）和N-钙黏蛋白（N-cadherin, N-cad）突变体（图2）神经管中细胞的代表性图像。后者显示，在N-cad突变体中，神经板侧向区域的细胞无法正常朝向中线定向（图2）。与此种嵌合标记方法相比，使用β-连环蛋白（beta-catenin）等通用细胞表面标志物对神经上皮进行免疫染色，则无法清晰呈现单个细胞的形态（图3）。
活体胚胎的延时成像与固定样本的嵌合标记相互补充，有助于更好地理解神经管形成过程中发生的细胞动态变化。影片1显示，野生型细胞通过伸出朝向中线的膜突起，主动向中线迁移。
图1. 野生型斑马鱼胚胎神经管中的mGFP表达。
图 2. N-钙黏蛋白斑马鱼胚胎神经管中的 mGFP 表达。
图3. 神经上皮中 β-catenin 的免疫染色。
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讨论
综上所述，本文所述的标记技术可实现对斑马鱼胚胎形态发生过程的单细胞分析。本实验方案主要侧重于在泛表达启动子调控下，利用mGFP对神经管中标记细胞进行成像的方法。关于该瞬时表达检测的其他应用，读者可参考Andersen et al.3近期发表的一篇论文。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了授予 R. Brewster 的美国国立卫生研究院基金（1R01GM085290-01A1）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
溶液 | |||
|
参考文献
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain
Posted by JoVE Editors on 9/16/2010. Citeable Link.
A correction was made to Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1
1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County
2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2
1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
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