Drosophila S2 细胞用于光学显微镜观察的制备

摘要

Drosophila Schneider（S2）细胞是基因发现与功能分析中日益常用的研究体系。我们的目标是介绍一些使S2细胞成为越来越重要的实验体系的显微技术。

摘要

理想的实验体系应具备成本低廉、易于维护、适用于多种技术手段的特点，并且拥有丰富的文献资料和基因组序列数据库支持。Drosophila S2 细胞系由离体培养的 20-24 小时龄胚胎发育而来¹，具备上述所有特性。因此，S2 细胞非常适合用于细胞过程的研究，包括鉴定参与特定过程或机制的分子组分所对应的基因。S2 细胞之所以具有广泛应用价值，主要归因于其易于培养的特性、对双链 RNA（dsRNA）介导的 RNA 干扰（RNAi）具有高度敏感性，以及无论是活细胞还是固定细胞，均可方便地进行荧光显微镜观察。

S2 细胞可在多种培养基中生长，包括多种价格低廉、商业化供应、成分完全明确且无血清的培养基²。此外，S2 细胞在 21–24°C 下生长最佳且增殖迅速，并可在多种容器中进行培养。与哺乳动物细胞不同，S2 细胞不需要控制气体环境，仅在正常空气条件下即可良好生长，甚至可在密封的培养瓶中维持培养。

在S2细胞中，RNAi操作的简便性可与通过相差显微镜或荧光显微镜对固定或活细胞中实验诱导的表型进行便捷分析相辅相成。S2细胞在培养中以单层形式生长，但不表现出接触抑制。相反，在高密度培养时，细胞倾向于形成集落状生长。在低密度下，生长于玻璃或组织培养处理过的塑料表面的S2细胞呈圆形且贴附松散。然而，通过将细胞短暂培养在涂有凝集素刀豆球蛋白A（concanavalin A, ConA）³的表面上，可显著改善S2细胞的细胞形态学特征，使其充分铺展。此外，S2细胞还可通过稳定转染表达荧光标记的探针，以标记活细胞或固定细胞中特定的结构或细胞器。因此，对细胞进行显微分析的常规流程如下：首先，对S2细胞（可携带表达标记探针的转基因）进行RNAi处理，以消除目标蛋白；RNAi处理时间可根据不同蛋白的 turnover 动力学进行调整，并在目标蛋白对细胞存活至关重要时，尽量减少细胞损伤或死亡。接着，将处理后的细胞转移至预先涂有ConA的培养皿中，其中的盖玻片可促使细胞铺展并牢固贴附于玻璃表面。最后，研究人员可根据需要选择合适的显微镜模式对细胞进行成像。由于S2细胞在室温及正常大气条件下仍能保持良好活性，因此特别适用于需要长时间观察活细胞的研究。

方案

1. 为显微镜观察准备 S2 细胞

Schneider S2 细胞源自 Oregon R 果蝇（Drosophila）晚期胚胎的胰蛋白酶消化产物。Schneider 最初的培养物包含多种细胞类型，但随着传代次数的增加逐渐趋于均一¹。这些细胞被描述为具有类似巨噬细胞的特性（具有吞噬能力），并表现出类似血细胞的基因表达模式。S2 细胞可从 ATCC、DGRC 或 Invitrogen 获得。

A. 培养基的选择

已有多种培养基用于培养S2细胞。以下提到的培养基均无需5% CO₂环境。

1. 施耐德最初使用其定义的培养基（施耐德果蝇培养基，Schneider's Drosophila medium），并添加10%热灭活的胎牛血清（FBS）。尽管FBS使该培养基比下文提到的无血清培养基更昂贵，但其自发荧光较低，因此适用于活细胞的落射荧光显微镜观察。然而，该培养基含有足够的金属离子，可诱导由金属硫蛋白启动子调控的转基因（例如亚克隆至Invitrogen的pMT载体中的基因）产生低水平表达，导致在诱导前即出现“渗漏性”基因表达。
2. 目前有多种无血清培养基可商业获取（例如Sf900 II、HyClone SFX-Insect和Insect-Xpress）。这些培养基相对便宜，但在使用金属硫蛋白启动子调控的转基因时，通常比施耐德培养基诱导更高水平的表达。此外，与施耐德培养基/FBS相比，这些培养基会产生明显的自发荧光（在进行活细胞荧光显微镜观察时需特别注意）。
3. 可选择性地向培养基中添加抗生素，通常为青霉素G和硫酸链霉素（终浓度分别为50–100单位/mL和50–100 μg/mL）。此外，也可添加抗真菌试剂两性霉素B至终浓度250 ng/mL。

B. 培养条件

S2 细胞在常规实验室温度和大气条件下易于培养。在对活体 S2 细胞进行长时间成像时，导致细胞死亡的主要原因是脱水和光毒性。通过在显微镜下的培养皿中保持足够的培养基，即可轻松防止脱水。而光毒性则是一个较为棘手的问题，需要在成像过程中尽量减少细胞对高强度、高能量光线的累积暴露，同时又要保证足够的成像频率，以充分的空间和时间分辨率捕捉到有意义的生物学事件。

1. 在组织培养塑料表面生长的S2细胞通常呈圆形，贴壁不紧密。当细胞长至融合时，会形成致密的单层，随后越来越多的细胞会脱落并悬浮生长。对于固定细胞和活细胞的显微观察，若能诱导细胞在盖玻片上铺展变平，成像效果将显著改善。该方法详见下文（2. A. 2.）。

2. S2 细胞的显微观察

A. 活细胞显微镜观察

我们使用倒置显微镜观察接种在玻璃底培养皿上的活体S2细胞。下文所述的玻璃底培养皿可使细胞保持在与其常规培养条件非常接近的状态，同时允许通过显微镜级玻璃对活细胞进行观察。

1. 玻璃底培养皿的制备
   
   组分：
   1. Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒
      该试剂用作将盖玻片粘附到培养皿上的胶水。试剂盒包含两种组分：树脂基质和固化剂，使用前需按 10:1（树脂 : 固化剂）的质量比混合。
      树脂/固化剂混合液的配制方法如下：
      1. 将约 5 g 树脂称量至塑料称量舟中，并记录树脂质量。
      2. 将树脂质量乘以 0.1，计算所需固化剂的量；使用新的移液管将相应体积的固化剂加入同一称量舟中。
      3. 充分搅拌以混合均匀。产生的气泡无需担心，会随时间缓慢消失。
      4. 胶水现已配制完成，呈蜂蜜状，至少可在 1 小时内使用。5.5 g 胶水可制作约 75 个培养皿，具体数量取决于涂胶时的用量。
   2. 塑料 35 mm 培养皿
      我们不使用细胞培养级培养皿，因为我们仅希望细胞附着于玻璃底部而非塑料表面，因此选用更便宜的标准培养皿。某些显微镜载物台配有用于固定 35 mm 培养皿的圆形夹具；若使用此类夹具，请确保所选培养皿能适配。值得注意的是，并非所有 35 mm 培养皿的外径完全相同。
   3. 盖玻片
      请根据显微镜类型和实验需求选择合适的盖玻片。可选用价格较高的特殊玻璃（如带光刻网格的玻璃，例如 Electron Microscopy Sciences，23×23 mm 圆形，带网格，1.5 号，货号 72264-23），也可选用价格较低的批量盖玻片（如 VWR，22×22 mm 方形玻璃，1.5 号，货号 48366-227）。注意：盖玻片尺寸必须略大于将在培养皿底部打制的孔（至少大 1 mm 左右），同时必须小于培养皿的直径。若选用方形盖玻片，需确保其能完全覆盖圆形孔并略微超出边缘，但不会触及培养皿侧壁。如需清洗盖玻片，请在粘附至培养皿前完成。
   4. 电钻
      我们使用带有可调转速和连续运行锁定按钮的手持电钻。使用台式钻床钻孔更为简便，但若仅需小批量制备玻璃底培养皿，则无需专门购置台式钻床。
   5. 钻头
      使用直径为 ¾ 英寸的扁钻头（spade drill bit）（该类型钻头可参考网页 http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit 上的图片）。钻头的直径决定了培养皿底部孔的直径。
   6. 锥形磨削钻头
      使用粗粒度、锥形的磨削钻头，其直径应与扁钻头相近。在所有孔钻制完成后，用此钻头去除孔边缘从培养皿底部突出的塑料碎片。若培养皿外表面残留塑料碎片，将导致盖玻片无法平整贴合。培养皿内表面轻微凸起的小塑料碎片无需处理，不会影响盖玻片或细胞。
   7. 厚壁聚苯乙烯泡沫箱
      用作钻孔操作的支撑面。在泡沫箱的一个外侧面贴上密封胶带（我们使用 1.5 英寸宽的 Scotch 密封胶带），以减少钻孔过程中聚苯乙烯泡沫碎屑的飞溅。
   
   组装步骤
   1. 将 35 mm 培养皿的底半部分置于泡沫箱已贴胶带的表面，确保其底部紧贴泡沫箱。在牢固握住培养皿侧壁的同时进行钻孔。注意：持握培养皿的手指距离旋转的钻头仅数毫米，存在危险。若培养皿开始旋转，请立即停止钻孔。如有台式钻床或可牢固固定培养皿的装置，建议使用。我们从未发生事故，但仍需采取一切必要措施确保操作安全。
   2. 完成所有培养皿的钻孔后，使用磨削钻头修整孔的外缘。我们将电钻侧放，使钻头伸出工作台边缘，并用重物（如装有 10 kg 沙子的重型塑料袋）压住电钻以固定其位置。开启连续运行按钮使电钻持续运转，然后手持每个培养皿，将其孔边缘与旋转的磨削钻头接触，以磨平新钻孔的粗糙边缘。
   3. 将所有培养皿底部放入大烧杯中，用蒸馏水多次冲洗以去除松散的塑料或泡沫碎屑（这些碎屑会漂浮在水面）。随后将培养皿底部取出晾干。
   4. 待培养皿干燥后，配制 Sylgard 184 胶水。在每个培养皿外表面的钻孔周围涂上一小圈胶水。胶水量不宜过多，否则会造成混乱。将盖玻片覆盖在孔上，使其与胶水接触。盖玻片应平整均匀地贴合在培养皿上。若胶水未完全均匀分布在孔周围，盖玻片与培养皿底部之间可能出现微小缝隙。初始阶段无需担心这些缝隙，胶水通常会自行渗入并填充。
   5. 完成所有盖玻片粘附后，检查是否存在未被胶水封闭的缝隙。在缝隙附近的盖玻片边缘滴加少量胶水，胶水将通过毛细作用渗入缝隙中。
   6. 将培养皿倒置（底部朝上）放置以干燥。室温下干燥可能需要一天或更长时间，但可通过将培养皿置于温控培养箱中加速固化过程。
   7. 若需要无菌培养皿，将培养皿底部和盖子放入组织培养超净台中并摊开摆放。切勿将盖子盖在底部上，而应将各部件翻转，使其内表面直接面向紫外灯。开启灭菌紫外灯至少 45 分钟。若计划对培养皿进行 ConA 涂层处理（见下文），则应在涂层完成后才进行灭菌。
   8. 培养皿现已准备就绪，可供使用。
2. 使用刀豆蛋白 A
   凝集素刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）被发现可刺激 S2 细胞在 ConA 涂层表面铺展变平³。当 S2 细胞接种至 ConA 涂层的盖玻片上时，细胞会铺展开来，成为显微镜观察的理想样本。
   1. 对普通盖玻片进行 ConA 涂层处理时，将清洗后的盖玻片平铺于实验台上固定好的 Parafilm 膜表面。在每片盖玻片表面滴加 10 μL 浓度为 0.5 mg/mL 的 ConA 溶液（溶于无菌水），然后将液体均匀涂布至盖玻片整个上表面。干燥后，将盖玻片存放在洁净干燥的容器中。涂层玻璃可在组织培养超净台中用紫外灯灭菌。
   2. 对玻璃底培养皿进行 ConA 涂层处理时，同样在玻璃的上表面（即朝向盖子的一面）滴加 10 μL ConA 溶液并涂布均匀。干燥后，可按上述方法进行灭菌。ConA 涂层的培养皿或盖玻片可在室温下保存，并可在制备后数月内使用。
3. 成像
   1. 轻轻重悬经 RNAi 处理的 S2 细胞，并将其转移至含 2 mL 培养基的 ConA 涂层玻璃底培养皿中。健康细胞接触 ConA 涂层盖玻片后会紧密黏附并开始铺展。此过程约 15 分钟内可见，通常在 45 分钟至 1 小时内完成。注意：由于细胞与 ConA 涂层表面紧密结合，附着的细胞无法进行胞质分裂，随时间推移将变为多倍体。接种至 ConA 涂层培养皿中的细胞可长期保持健康状态，但不会在此类培养皿中增殖。
   2. 细胞附着后，若旧培养基具有自发荧光，可更换培养基。但对于使用共聚焦显微镜、去卷积显微镜或配备小景深物镜的宽场显微镜的研究，此步骤可能非必需。
   3. 由于 S2 细胞在室温及正常大气条件下状态良好，因此在显微镜观察时无需特殊环境或设备。我们常对活体 S2 细胞进行长时间延时成像。实际操作中，此类实验的持续时间通常受限于光漂白和光毒性等常见问题。

B. 固定细胞显微镜观察

1. 玻璃底培养皿与普通盖玻片：在固定细胞时，这两种均可使用。若使用普通盖玻片，可将单个ConA包被的盖玻片放入一个独立的35 mm培养皿中（该培养皿无需为组织培养级），加入2 mL培养基，然后将RNAi处理的细胞转移至培养皿中。待细胞贴附于盖玻片后，移除培养基，用适当的缓冲液（如PBS）短暂洗涤细胞，然后向培养皿中加入固定液（见下文）。之后，可将盖玻片从培养皿中取出并进一步处理，例如进行免疫染色。
2. 固定：已有多种方法用于固定S2细胞。最佳固定方法取决于固定剂在保持目标结构特征的同时，是否不会破坏或丢失抗原表位或标签蛋白。某些实验流程在固定前需要进行提取步骤，以暴露位于致密或紧凑结构中的某些蛋白的抗原表位。由于关于S2细胞的文献较为丰富，通常可以找到已发表的方法，以最优方式固定您感兴趣的S2细胞结构。
   1. 甲醇是一种常用固定剂。甲醇应为低温（至少-20°C）且无水（可向甲醇中加入3A型分子筛以去除水分）。我们将约300 mL无水甲醇置于带盖的1 L玻璃烧杯中，放入防爆-20°C冰箱预冷。当甲醇冷却后，将其从冰箱中取出，迅速移除玻璃底培养皿（或含盖玻片的培养皿）中的培养基，然后快速将培养皿浸入甲醇中并保持浸泡状态。该烧杯中的甲醇通常可容纳约十几个培养皿。操作应迅速，并尽快将烧杯（连同培养皿）放回冰箱。固定在10–15分钟内完成。之后，将培养皿从烧杯中取出，倒掉其中残留的甲醇，并通过加入PBS / 0.1% Triton X-100对样品进行再水化。此时样品即可进行常规染色操作。
   2. 甲醛是另一种常用固定剂。我们使用含10%甲醛的缓冲液（PBS可接受，但应根据实际需求选择最合适的缓冲液）。我们采用相对较高浓度的甲醛，是因为S2细胞缺乏细胞质中间纤维，而后者通常有助于在固定过程中维持细胞形态和结构组织。
   3. 将固定液倒入废液杯中，并用PBST（PBS + 0.1% Triton X-100）对固定后的细胞进行三次短暂洗涤。
   4. 随后，向细胞中加入1 mL封闭液，封闭15分钟。我们常规使用含5%正常山羊血清的PBST作为封闭液。
   5. 倒掉封闭液，直接将一抗抗体（用封闭液稀释）加至细胞上。100 μL抗体溶液应足以完全覆盖细胞。盖上培养皿盖，防止抗体溶液蒸发。室温孵育30分钟。
   6. 移除一抗溶液，用PBST进行三次洗涤。使用移液管向培养皿中加入2 mL PBST，每次洗涤间隔5分钟（无需晃动培养皿）。
   7. 倒掉最后一次洗涤液，直接向细胞中加入100 μL二抗抗体（用封闭液稀释）。盖上培养皿盖，防止抗体溶液蒸发。室温孵育30分钟。
   8. 移除二抗溶液，用PBST进行三次、每次5分钟的洗涤。最后一次洗涤结束后，直接向细胞上滴加数滴所选封片剂。我们使用0.1 M没食子酸丙酯溶于甘油:PBS（9:1）的溶液，并于20°C保存。盖上培养皿盖，将培养皿置于避光环境中保存。

3. 局限性/问题

与任何实验系统一样，S2细胞的使用也存在局限性。首先，培养的S2细胞通常有较低的有丝分裂指数（在无血清培养基中约为1%），而许多转化的哺乳动物细胞系的有丝分裂指数可高出10倍。因此，在研究有丝分裂表型时，需要更长时间在S2细胞培养物中寻找处于合适分裂阶段的细胞。其次，在细胞周期研究中，药物处理能非常有效地将S2细胞阻滞在特定的细胞周期时相。然而，在培养的哺乳动物细胞中具有可逆性细胞周期阻滞效应的化合物，在S2细胞中却难以通过洗脱去除。因此，目前尚未建立有效的增殖性S2细胞同步化方案。第三，S2细胞不具备迁移能力，也不表现出上皮细胞特征。

4. 预期结果

S2细胞最大的优势在于其作为模式系统的实用性。它们特别适用于研究目标蛋白的细胞功能：可通过在实验室中轻松（且相对廉价）合成的dsRNA对S2细胞进行RNAi处理，且S2细胞适用于活细胞分析以及固定细胞的免疫荧光检测。此外，S2细胞的一个重要优势是其在实验室中易于培养，仅需使用相对廉价的无血清培养基，且无需组织培养用的恒温培养箱。

一个典型的实验包括将S2细胞接种于适当的组织培养容器（例如6孔板或96孔板）中，向各孔加入自制的dsRNA，随后在RNA干扰逐渐耗尽靶蛋白的过程中维持细胞培养。根据所耗尽的靶蛋白不同，细胞可能因靶蛋白表达下调而出现形态学和/或行为学上的变化。将靶蛋白表达降至最低所需的时间因蛋白而异，应通过Western blotting确定。

通常情况下，S2细胞不会紧密黏附于塑料或玻璃表面，这将对需要显微镜观察处理后细胞的实验造成困难。然而，只需将S2细胞接种在涂有凝集素刀豆球蛋白A（concanavalin A, ConA）的表面，即可诱导其充分铺展变平。接种于ConA表面约1小时后，大多数细胞因在ConA表面广泛铺展而失去原有的圆形形态（图1）。此时细胞已准备好进行后续处理（例如固定和免疫染色）或活细胞的显微观察。

S2 细胞也可通过多种化学试剂或电穿孔法进行转染，以实现外源基因的瞬时表达，或将其稳定整合至基因组中（从而建立可在多次分裂中维持外源基因的细胞系）。转染可用于多种目的，例如表达荧光标记蛋白，用于在固定或活细胞中标记特定结构（图2），或作为诱饵用于 体内 pull-down 或免疫共沉淀实验等

分析方法的选择当然取决于实验所要解决的生物学问题。对经RNAi处理的S2细胞进行分析的常用方法是固定细胞的免疫荧光染色（图3）。例如，免疫荧光通常用于全基因组范围的筛选实验中 果蝇 基因文库以快速鉴定具有有趣活性的蛋白质 体内可通过同时耗竭S2细胞中的多种靶蛋白来进一步完善分析，以检测靶蛋白之间可能存在的功能相互作用。此外，该分析还可拓展至活细胞，以观察RNAi对动态过程的影响。S2细胞尤其适用于此类分析，因其可接种于ConA包被的玻璃底培养皿上，并在倒置显微镜下连续观察数小时，而无需使用环境培养舱。

图 1. S2 细胞接种于刀豆球蛋白 A 包被的玻璃底培养皿后拍摄的相差显微图像（20 倍放大）。数字表示接种后的分钟数。注意细胞在包被的盖玻片上铺展时相位变暗。细胞铺展在 15 分钟时已明显可见（箭头），至 60 分钟时基本完成。右侧面板：贴壁细胞的放大图像；其延伸并铺展的边缘清晰可见（箭头头）。比例尺（适用于左侧四个面板），20 μm。

图 2. 瞬时转染了融合构建体的S2细胞，该构建体由核仁磷酸蛋白（细胞核标记物）与荧光蛋白eGFP（绿色）融合而成。这些细胞被接种在刀豆蛋白A（ConA）包被的玻璃底培养皿上，随后使用微分干涉相差显微镜（DIC）和落射荧光显微镜进行成像。比例尺，15 μm。

图3. 固定后的S2细胞经免疫染色显示PLP（绿色；中心粒标记物）、微管（红色）以及染色体（Hoechst染色，蓝色）。在固定和免疫染色前，细胞分别接受了为期4天的对照RNAi或靶向Ncd的RNAi处理，Ncd是一种驱动纺锤极“聚焦”的驱动蛋白样蛋白⁴。注意经Ncd RNAi处理的细胞中出现发散的纺锤极和紊乱的纺锤体结构。比例尺，2.5 μm。

讨论

对于细胞生物学领域而言，理想的实验体系应具备成本低廉、易于操作，并适用于多种技术方法的特点。Drosophila S2 细胞满足这些要求，因此已迅速成为越来越多细胞生物学实验室的首选体系。

我们简要介绍了制备S2细胞用于显微镜观察的方法。S2细胞的一个显著优点是其在正常空气环境和室温条件下生长良好，因此可在显微镜下长时间观察而无需特殊的维持条件。尽管在常规培养条件下，S2细胞通常呈一定程度的圆形且贴附较松散，但可通过诱导使其充分铺展，便于成像。将S2细胞培养在预先用刀豆蛋白A（concanavalin A）包被的玻璃底培养皿上，细胞会牢固贴附并在盖玻片上形成薄层，是极佳的显微观察样本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
S2 细胞	ATCC	CRL-1963	http://www.atcc.org/
S2 细胞	DGRC	货号 6	https://dgrc.cgb.indiana.edu/
S2 细胞	Invitrogen	R690-07
Sf900 II	Invitrogen	10902-096	无血清培养基
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30278	无血清培养基
Insect-Xpress	BioWhittaker	12-730	无血清培养基
Schneider’s S2 培养基	Invitrogen	11720-034	加入 10%（终浓度）热灭活胎牛血清以配制完全培养基。
胎牛血清	Invitrogen	10438026	热灭活
100 倍抗生素溶液	MP Biomedicals	91674049	含青霉素（10000 U/mL）、 链霉素（10000 μg/mL）和 两性霉素 B（25 μg/mL）
刀豆蛋白 A	MP Biomedicals	195283
甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714	32% 溶液
甲醇	Mallinckrodt Baker Inc.	9049	无水，ACS 级
分子筛	Acros Organics	19724	3A 型