建立颅内脑肿瘤异种移植模型并利用生物发光成像分析肿瘤生长及治疗反应

摘要

可通过颅内接种在裸鼠体内建立表达荧光素酶的人脑肿瘤异种移植模型，并利用生物发光成像技术对肿瘤生长及治疗反应进行后续监测。结合生存分析，生物发光监测是针对脑肿瘤治疗方案开展临床前研究的重要工具。

摘要

多年来，利用人脑肿瘤细胞的移植模型在神经肿瘤学研究中发挥了重要作用。过去，建立人源肿瘤异种移植模型最常用的方法是从培养瓶中收集细胞，随后将收集的细胞注射到免疫缺陷小鼠的皮下。尽管该方法目前仍在许多实验室中广泛使用，但在过去十年中，研究重点已显著转向原位异种移植模型的建立，对于脑肿瘤而言，这需要将肿瘤细胞注射到相应的神经解剖结构中。由于颅内异种移植无法通过直接测量（如使用游标卡尺）来监测肿瘤生长情况，因此对原位脑肿瘤异种移植模型的重视促使研究人员必须采用非侵入性成像技术来评估宿主动物体内的肿瘤负荷。在目前可用的成像方法中，生物发光检测通常被认为在灵敏度、操作便捷性和成本方面具有最佳的综合优势。本文中，我们将演示原位脑肿瘤模型的建立过程，以及在测试实验性疗法时监测肿瘤生长及其对治疗反应的方法。

方案

1. 肿瘤细胞制备。

人脑肿瘤异种移植的细胞可来源于在裸鼠体内以皮下生长方式传代的肿瘤，也可来源于细胞培养。下文将讨论这两种细胞来源的使用方法，并演示一种细胞植入技术。

为将皮下肿瘤细胞制备用于颅内移植，切除的侧腹肿瘤组织被置于培养皿中，首先使用手术刀将组织切碎，随后通过反复吹打进行机械性解离，以制备细胞团悬液¹。将细胞团悬液经70 μM尼龙滤网过滤，获得适用于颅内注射的单细胞悬液。细胞悬液在4°C条件下以1000 rpm离心10分钟，吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于适当体积的无血清培养基中，以获得最终工作浓度（见下文）。对于已建立的细胞系进行颅内移植前的制备，可通过胰酶消化单层细胞，或收集神经球悬浮培养物，随后按上述方法离心并重悬细胞²。注射细胞数量根据注射部位的神经解剖位置而有所不同。对于幕上区域注射，常规注射3–5 × 10⁵个细胞于3 μL无血清培养基（DMEM）中；而对于脑干注射³，则可在0.5 μL中注射低至5 × 10⁴个细胞。注射体积超过推荐值可能导致肿瘤细胞沿针道反流，从而引起外生性生长（图1），而非颅内肿瘤生长。在取出用于颅内注射的样本后，剩余细胞悬液应置于冰上，并在完成同一批次动物的颅内成瘤操作期间频繁混匀，以维持适当的细胞浓度。

2. 肿瘤细胞移植

请注意，下述所有操作步骤均已通过加州大学旧金山分校机构动物使用与护理委员会的审查和批准。

1. 应使用消毒剂（如 2% 氯己定溶液）喷洒手术区域的所有表面以进行准备。使用消毒剂后，应将以下物品放置于手术区域：
   • 加热垫，用于维持小鼠体温
   • 两个小型培养皿；一个盛有 3% 过氧化氢，另一个盛有 2% 氯己定
   • 无菌纱布和棉签
   • 无菌一次性手术刀
   • 经高压灭菌的外科缝合器
2. 麻醉应采用注射麻醉剂，通常使用氯胺酮-赛拉嗪混合物。
3. 小鼠麻醉后，用浸有氯己定溶液的无菌纱布反复擦拭头皮进行消毒。术中应涂抹眼膏以维持角膜适当的湿润度。使用无菌手术刀在顶枕骨区域做长约 1 cm 的矢状切口。随后用浸有 3% 过氧化氢溶液的棉签清洁暴露的颅骨表面。此时应能清晰看到前囟（见视频）。
4. 肿瘤细胞注射的坐标取决于期望的成瘤部位。以下为我们用于建立颅内肿瘤模型的注射方法²，该位置是许多脑肿瘤患者常见的肿瘤发生区域。脑肿瘤研究中的其他感兴趣区域包括脑桥，用于脑干肿瘤的解剖学建模³，以及硬膜下注射，用于模拟脑膜肿瘤的位置⁴。在注射肿瘤细胞前，使用无菌的 25 号锐利针头在前囟右侧 2 mm、冠状缝前方 1 mm 处穿刺颅骨，以形成细胞注射孔（见视频）。该方法在小鼠和大鼠中均适用（大鼠使用 22 号针头）。
5. 在将细胞吸入注射器前，轻轻弹击细胞悬液管壁以混匀内容物。小心吸取所需体积的细胞悬液，避免产生气泡。随后用酒精棉片擦拭注射器外表面，去除可能附着的细胞，以防止颅外成瘤和肿瘤生长（图 1A）。为确保准确的注射深度，使用手术刀将 P20 移液器吸头尖端切去 3 mm。该截短的吸头可套在注射器上，用于限制进针深度，并确保注射器针尖距离颅骨内表面 3 mm。将注射器垂直插入先前打好的孔中，缓慢注入细胞悬液（3 μL 悬液应在 1 分钟内完成注射）。注射角度不当可能导致细胞注入脑室内，并引发脊髓播散（图 1B：右侧）。注射完成后，将针头留置原位 1 分钟，然后缓慢拔出（见视频）：这些步骤有助于减少肿瘤细胞反流。
6. 作为非辅助或徒手进行颅内肿瘤细胞植入⁵的替代方法，可使用小型动物立体定位仪（示意图中的 F 面板），该方法通常可提高注射位置的一致性，但会显著增加操作时间。根据我们的经验，两名手术人员采用徒手方法每小时可注射多达 60 只小鼠，而使用小型动物立体定位仪的最大注射速率为每小时约 15 只小鼠。在需要注射大量小鼠时，操作效率是一个重要考虑因素，有助于缩短肿瘤细胞在冰上保存的时间。
7. 用 3% 过氧化氢清洁颅骨，并用无菌干棉签擦干。将无菌骨蜡涂抹于钻孔处。使用镊子将头皮拉拢覆盖颅骨，并用缝合钉闭合切口。为获得最佳愈合效果，应使头皮两侧的真皮层相对贴合（即内侧对内侧）。缝合后的头皮应用氯己定溶液清洁，随后通过皮下注射给予布托啡诺以缓解术后疼痛。
8. 所有小鼠术后均需密切监测，直至其恢复自主活动并表现出正常行为。通常恢复时间约为 30 分钟。

3. 肿瘤生长的生物发光监测

1. 背景。生物发光成像（BLI）基于在氧气和三磷酸腺苷（ATP）存在下，荧光素（d-(-)-2-(60-羟基-20-苯并噻唑基)-噻唑-4-羧酸）的氧化反应。该反应由荧光素酶催化，将化学能转化为光子，从而发射出光。人类细胞可被改造以表达荧光素酶（见下文），只有表达荧光素酶的细胞在荧光素底物存在时才能发光。经荧光素处理的动物宿主自身产生的背景发光极低，因此检测荧光素酶修饰的肿瘤细胞所发出的发光信号具有非常理想的信噪比，可在活体中高灵敏度地监测肿瘤生长及对治疗的反应。此外，已有研究表明荧光素酶及其底物荧光素对哺乳动物细胞无毒性，我们亦未观察到表达荧光素酶的细胞与其相应的未修饰细胞之间存在功能差异。荧光素在小鼠经腹腔（i.p.）或静脉（i.v.）注射后可迅速穿过细胞膜和血脑屏障，从而实现对含有荧光素酶修饰细胞的所有组织区域进行成像。荧光素酶修饰细胞所发射的光子强度和光谱范围足以穿透小动物（如小鼠和大鼠）的组织，并可通过低光照成像相机从体外检测。生物发光成像的非侵入性特点使得可在同一动物个体中反复监测肿瘤生长及对治疗的反应。
2. 植入的细胞来源应稳定表达萤火虫荧光素酶。此类细胞来源可直接购买，或由各实验室使用构建用于组成型表达荧光素酶的慢病毒自行制备。我们强烈建议使用荧光素酶编码慢病毒感染的细胞，而非质粒转染的细胞，以确保在体内实现荧光素酶的稳定细胞表达，这对于在实验过程中对同一动物个体进行多次成像时，通过定量发光成像准确反映肿瘤负荷的变化至关重要。
3. BLI监测。我们建议在肿瘤细胞注射后一周开始，每周进行1至2次定量生物发光成像（qBLI）。我们的qBLI使用IVIS Lumina成像系统（Caliper Life Sciences），实验结果表明，使用IVIS Lumina、IVIS 150或IVIS 200成像系统均可获得相似的数据。成像前，小鼠同时接受氯胺酮/赛拉嗪麻醉，并通过腹腔注射给予荧光素（D-荧光素钾盐，150 mg/kg，Caliper Life Sciences），注射后12分钟进行成像。荧光素的药代动力学表明，为获得最大发光强度和最高检测灵敏度，应在注射荧光素后10至15分钟内测定细胞发光信号。在10至15分钟的时间窗口内所选择的具体时间点应在所有成像动物之间保持一致。保持从注射荧光素到获取BLI读数之间的时间间隔恒定极为重要。使用Living Image软件定义包含颅内信号区域的兴趣区（图2），并记录总光子数/s/sr/cm²（每秒每球面度每平方厘米的光子数）（见视频）。
4. 数据分析。尽管肿瘤生长和治疗反应是在个体动物中进行监测，但我们强烈建议每组治疗组至少包含8只动物，以提高关于肿瘤对治疗有无反应的结论的统计学可靠性。在展示qBLI结果时，将每只小鼠在治疗期间及治疗结束后获得的发光值除以其相应的治疗前最大发光值，从而转换为归一化数值^6,7。对于生存分析，采用Kaplan-Meier估计法⁸生成生存曲线，并确定中位生存时间。不同生存曲线之间的差异通过log-rank检验进行比较⁹。
5. 治疗与未治疗肿瘤脑组织的取材以供后续分析。在动物安乐死后，应迅速取出小鼠脑组织（见视频），可将其置于福尔马林中用于后续肿瘤形态学和免疫组织化学分析，或包埋于OCT包埋剂中进行冷冻保存。

4. 代表性结果

在图3A所示的示例中，接受颅内肿瘤细胞注射的小鼠通过监测颅内生物发光信号，直至连续的平均发光值表明肿瘤呈进行性生长，此时开始治疗（灰色箭头起始于第34天：每日给予150 mg/kg厄洛替尼，直至需要实施安乐死）。每只小鼠在治疗开始时的发光值被归一化为1，后续每次成像的发光值均以其治疗前最后一次成像的发光值为基准进行归一化处理。例如，某只小鼠在第34天治疗前的最终发光读数为2.0 × 10⁷ 光子/秒，到第38天时发光值上升至6.0 × 10⁷ 光子/秒，则该小鼠在第38天的归一化发光值为3.0。针对每次成像时间点，分别绘制对照组与治疗组的平均归一化生物发光值及其对应的标准误。在此示例中，治疗开始后的首次成像时间点（第38天）即可见两组间平均归一化发光值存在显著差异，且后续时间点的组间平均发光值差异进一步增大。在大多数情况下，qBLI所反映的治疗抗肿瘤活性会伴随生存期出现相应的显著差异（即 p < 0.05），本例即如此（图3B）。图3C和3D显示的是小鼠安乐死后获取的脑组织相邻切片，经甲醛固定、石蜡包埋并切片后，分别进行苏木精-伊红（H&E）染色和抗EGFR免疫组化染色的结果。

图1. 颅内注射错误的指征。A) 外生性（颅外）肿瘤生长（红圈）可能由注射体积过大、细胞悬液残留在注射器针头、或注射肿瘤细胞后过快拔出注射器所致。B) 若将肿瘤细胞注入脑室，可导致肿瘤沿脊髓播散（右侧小鼠）；而正确注射的肿瘤细胞信号则局限于注射部位（左侧小鼠）。

图2. 治疗反应实验中对照组（左）和处理组（右）代表性小鼠的生物发光强度热图图像表示。Living Image 软件可设置以定义感兴趣区域（红色圆圈），或由仪器操作人员手动定义感兴趣区域。在使用此类图像进行图示构建时，我们建议仪器操作人员采用相同的生物发光热图范围（图的上部）显示热图图像，以便直观展示不同实验动物之间生物发光差异的程度。

图3. 显示治疗反应的实验中的生物发光、生存率及肿瘤组织分析。A) 对照组与治疗组小鼠的平均生物发光读数曲线图，每个成像时间点均标示标准误。B) 同一批小鼠的生存曲线图；p值通过log-rank检验确定⁷。C) 含肿瘤的小鼠脑组织H&E染色切片。D) EGFR染色切片。E和F) 分别为C和D图中指定区域的放大图像，其中E图显示肿瘤抑制蛋白PTEN呈阴性染色。

讨论

原位（颅内）脑肿瘤异种移植模型的建立为中枢神经系统癌症的治疗反应研究提供了合适的微环境¹⁰。此类模型还可提供有关治疗药物进入脑组织及脑肿瘤的信息，这对于判断实验性药物是否应推进到临床试验阶段至关重要。由于颅内异种移植肿瘤的体积无法像皮下肿瘤那样通过游标卡尺直接测量，因此对颅内肿瘤生长及其治疗反应的纵向监测需要依赖非侵入性影像技术；根据我们的经验，当实验的主要目标是评估肿瘤对治疗的反应程度时，生物发光成像是一种最为实用的方法。当生物发光成像结果与动物生存分析相结合时，这两组数据可为评估实验性治疗效果提供一种强大且可靠的方法。

最后，为了评估治疗对肿瘤形态学和分子水平的影响，必须在动物安乐死后立即获取颅内脑肿瘤异种移植组织；为此，我们更倾向于在实施安乐死时进行全脑切除，并保存切除的脑组织以供后续分析。

尽管前述内容主要针对脑肿瘤研究，但这些概念显然可推广至其他适用于啮齿类动物原位建模的人类癌症。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一次性手术刀	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	No.21
加热垫	Dunlap	HP950
纱布	Fisher Scientific	22028563
棉签	Fisher Scientific	23-400-100
2% 氯己定	Fisher Scientific	NC9756995
3% 过氧化氢	Fisher Scientific	H312P-4
25g 针头	BD Biosciences	305122
10 µl Hamilton 锐利微量注射器	Hamilton Co	20734
皮肤缝合器及缝合钉	Stoelting Co.	59020
立体定位仪	Stoelting Co.	51725
Living Image 软件	Caliper Life Sciences
D-荧光素	Gold Biotechnology	LUCK-1G	钾盐
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences