荧光显微镜下观察细胞电融合

摘要

在本视频中，我们展示了高效的细胞电融合方法 体外 通过使用电穿孔的改良黏附法，随后借助荧光显微镜观察融合细胞的荧光信号实现检测。

摘要

细胞电融合是一种安全、非病毒性且非化学性的方法，可用于制备用于人类治疗的杂交细胞。电融合涉及对紧密接触的细胞施加短暂的高电压电脉冲。施加短暂的高电压电脉冲会导致细胞质膜的不稳定。不稳定的膜对不同分子具有更高的通透性，并且容易与任何邻近的不稳定膜发生融合。因此，电融合是一种实现高度不同细胞非特异性融合的便捷方法in vitro为了实现细胞融合，细胞膜需在电场作用下发生去稳定化，并紧密接触，从而使其脂质双分子层相互合并，进而实现细胞质的融合。在本视频中，我们展示了高效的细胞电融合方法in vitro通过改良的贴壁法进行。在此方法中，细胞仅轻微贴附于孔板表面，以便更换培养基，同时细胞仍保持其球形形态。细胞融合的可视化通过预先用不同的荧光细胞示踪染料标记细胞的细胞质来实现；其中一半细胞用橙色CMRA标记，另一半细胞用绿色CMFDA标记。融合率的计算方式为双荧光细胞数量除以总细胞数量再乘以2。

方案

一、使用细胞示踪剂 CMFDA 和 CMRA 负载细胞

1. 实验使用预先培养的小鼠黑色素瘤细胞系（B16-F1）细胞进行。将细胞分别接种于两个25 cm²的培养瓶（TPP, ZDA）中，在含10%胎牛血清、0.15 mg/ml L-谷氨酰胺、16 mg/ml庆大霉素（均来自Sigma-Aldrich，德国）和200单位/ml结晶青霉素（Pliva，克罗地亚）的DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）中培养至70–80%汇合度，并在37°C、5% CO₂条件下孵育。
2. 通过向Invitrogen原装小瓶中的50 μg染料分别加入10.76 μl和9 μl二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，德国），配制两种10 mM的细胞示踪剂（Cell trackers，Invitrogen，美国）储备液。储备液可在4°C冰箱中保存数月。实验开始前，将溶液温育至DMSO晶体完全溶解。
3. 配制无碳酸氢盐的Krebs-Hepes缓冲液（130 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH₂PO₄、11.7 mM D-葡萄糖、1.3 mM CaCl₂、10 mM HEPES，pH 7.4）。在两个15 ml离心管中，分别将2.1 μl的上述储备液（10 mM CMFDA或CMRA）加入3 ml无碳酸氢盐的Krebs-Hepes缓冲液中，混匀，得到含约7 μM CMFDA（或CMRA）的“负载溶液”。
4. 用无碳酸氢盐的Krebs-Hepes缓冲液冲洗细胞两次，然后将负载溶液加入培养瓶中。在37°C、5% CO₂条件下孵育30分钟。在此初次孵育过程中，试剂可自由穿过细胞膜；但进入细胞后，试剂会转化为不能透过细胞膜的荧光反应产物。
5. 初次孵育结束后，用培养基冲洗细胞，并继续在37°C、5% CO₂条件下用培养基孵育2小时。
6. 将两个培养瓶（分别负载CMFDA和CMRA）中的细胞进行胰酶消化，并在50 ml离心管（TPP, ZDA）中按1:1比例混合红、绿标记细胞。通过加入DMEM培养基稀释或离心浓缩，调节细胞浓度至5 × 10⁶ 个细胞/ml。在24孔板（TPP, ZDA）的每个孔中加入20 μl细胞悬液。在37°C、5% CO₂条件下孵育20分钟，使细胞轻微贴附于孔板表面并形成细胞间接触。

II. 电融合

1. 配制等渗磷酸钾缓冲液（10 mM KH2PO4、10 mM K₂HPO₄、1 mM MgCl₂、250 mM 蔗糖）和低渗磷酸钾缓冲液（10 mM KH2PO4、10 mM K₂HPO₄、1 mM MgCl₂、75 mM 蔗糖）。
2. 将含细胞的多孔板置于显微镜载物台上，将电极放置于孔底部，并将其连接至脉冲发生器。
3. 用 1 ml 等渗磷酸钾缓冲液洗涤细胞，然后加入 350 μl 低渗磷酸钾缓冲液以诱导细胞肿胀。缓冲液应覆盖电极。
4. 在施加电脉冲前，将细胞置于低渗缓冲液中静置 2 分钟。在此期间，由于细胞内外渗透压失衡，水分子进入细胞，导致细胞体积增大。应在细胞接近最大体积但尚未启动调节性容积减小前施加电脉冲。
5. 为实现最佳电融合效果并维持细胞活力，应采用最优的电脉冲参数，具体参数取决于所用细胞系 [1]。本实验中，使用电穿孔装置（本实验采用 Cliniporator，IGEA，意大利）对每个样品施加 8 个矩形脉冲（每个脉冲持续 100 μs，频率为 1 Hz）。脉冲通过两根平行的铂/铱丝电极传递，电极直径为 0.8 mm，间距为 5 mm，在每个孔中形成约 1200 V/cm 的电场强度（对照孔除外）。
6. 脉冲施加后，静置细胞 10 分钟。通过荧光显微镜和相差显微镜检测融合率。

III. 图像采集与融合率的确定

1. 使用配备物镜（×20）和冷却CCD相机（VisiCam 1280，Visitron，德国）的荧光显微镜（本实验中使用Zeiss AxioVert 200，Zeiss，德国）观察细胞。图像在MetaMorph 7.1.1软件（Molecular Devices，美国）中采集，但也可使用其他类似的图像采集软件。CMFDA使用单色器（Polychrome IV，Visitron，德国）在492 nm激发，CMRA在548 nm激发。CMFDA和CMRA的荧光信号通过两个发射滤光片采集，一个中心波长为535 nm（HQ535/30m，用于CMFDA），另一个中心波长为605 nm（D605/55m，用于CMRA，均来自Chroma，美国）。使用二向色镜（Q515LP）可避免通道间的串扰。
2. 在每个孔中随机选择五个视野，分别采集三幅图像（相差图像、红色和绿色荧光图像）。从每组三幅图像中生成三通道图像。在此类图像中，可同时观察到荧光标记的细胞质和细胞膜，因此可轻松识别融合细胞[图1]。
3. 在每幅三通道图像中计数所有三种类型的细胞（仅红色荧光、仅绿色荧光以及双荧光标记的细胞）。通过将双荧光细胞数量除以每幅图像中总细胞数量，计算双荧光细胞所占百分比。融合效率定义为双荧光细胞百分比乘以2，因为当同色细胞发生融合时，有一半的融合细胞无法被检测到。

代表性结果

图1. B16F1细胞电融合后的三通道显微图像：相差图像、CMRA荧光（激发波长548 nm）和CMFDA荧光（激发波长492 nm），物镜放大倍数20x

讨论

细胞膜非特异性融合的能力（例如通过外加电场实现）在生物技术、医学以及生物学研究中具有重要意义。这种非特异性融合能够生产出极具价值的杂交细胞及其产物（如单克隆抗体），并有助于揭示融合的基本机制[2]。电融合是一种潜在的高效方法，因为它可以根据不同类型细胞的特点进行适当调整。当紧密接触的细胞受到高压电脉冲作用而进入融合活性状态（即易于发生融合的状态）时，即可实现电融合。电融合的效率取决于多种参数，这些参数影响电融合过程的两个阶段。电融合过程的第一阶段是实现细胞间的紧密物理接触，这一目标可通过多种方法实现[3-8]。黏附法（将细胞培养至汇合状态）可有效利用细胞间自发形成的广泛接触区域；然而，该方法会产生体积巨大且含多个细胞核的融合细胞。我们采用的是改良的黏附法，由此获得的融合细胞体积较小（含2至5个细胞核），更有可能存活并增殖（图1）。实验中采用的渗透处理可引起细胞渗透性肿胀，也有利于细胞间的接触[9]。电融合过程的第二阶段是使细胞膜达到融合活性状态。融合活性状态与细胞膜的电穿孔状态高度相关（即细胞膜非特异性地对正常情况下无法通过完整膜的分子通透），并且受相同电脉冲参数（幅度、持续时间、次数和频率）的调控[10]。不同细胞实现最佳电穿孔[1]和电融合所需的电学参数各不相同，取决于细胞大小及其生物学特性。因此，针对用作融合伙伴的不同细胞系，必须优化相应的电学参数以实现有效融合。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CMRA	试剂	Invitrogen	C34551	胞质荧光染料
CMFDA	试剂	Invitrogen	C7025	胞质荧光染料
DMSO	试剂	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	试剂	Sigma-Aldrich	D5671	杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）
胎牛血清	试剂	Sigma-Aldrich	F4135
L-谷氨酰胺	试剂	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	试剂	Pliva	625110	抗生素
庆大霉素	试剂	Sigma-Aldrich	G1397	抗生素
Hepes	试剂	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	试剂	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	试剂	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	试剂	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	试剂	Fluka	71382
KCl	试剂	Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	试剂	Sigma-Aldrich	M2643
D-葡萄糖	试剂	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	试剂	Sigma-Aldrich	C4901
蔗糖	试剂	Sigma-Aldrich	16104
电脉冲发生器	工具	IGEA		Cliniporator VITAE
多孔板	工具	Techno Plastic Products	92424
50 ml 离心管	工具	Techno Plastic Products	91050
15 ml 离心管	工具	Techno Plastic Products	91015
25 cm2 培养瓶	工具	Techno Plastic Products	90026
电极	工具	定制		Pt/Ir