荧光显微镜下细胞电融合的可视化

Summary

在这个视频中，我们表现出高效的细胞电融合在体外修改坚持使用电和随后的细胞融合与可视化荧光显微镜检测方法。

Abstract

细胞电融合是一种安全，非病毒性和非化学的方法，准备为人类治疗的杂交细胞，可用于使用。电熔涉及短期高电压密切联系的细胞的电脉冲的应用。总之，高电压的电脉冲的应用会导致不稳定的细胞质膜。不稳定的膜是不同的分子和通透性增加，也容易与任何邻国的不稳定，膜融合。电熔是一个方便的方法来实现一个非常不同的细胞非特异性融合

Protocol

一，载入的细胞与细胞的跟踪CMFDA和CMRA

1. 实验在先前准备的细胞的小鼠黑色素瘤细胞株（B16 - F1）。细胞是生长在两个分开25厘米²培养瓶（TPP，ZDA）70-80％汇合（贝科改良Eagle培养基）DMEM培养液中，辅以10％胎牛血清，0.15 mg / ml的L -谷氨酰胺，16毫克/ ml的庆大霉素（Sigma - Aldrich公司，德国的所有），200单位/毫升crystacillin（Pliva公司，克罗地亚），并在5％的_CO 2在37 ° C 。
2. 准备加入10.76μl和9μLDMSO（Sigma - Aldrich公司，德国）（分别为绿色CMFDA和橙色CMRA）50微克的染料在原有两个细胞纤夫10毫米股票的解决方案（Invitrogen公司，美国） Invitrogen公司的小瓶。原液可存放在冰箱在4 ° C几个月。在开始实验之前，热身的解决方案，直到二甲基亚砜晶体溶解。
3. 准备碳酸氢克雷布斯HEPES缓冲液（130毫米氯化钠，氯化钾4.7毫米，1.2毫米硫酸镁_4，1.2毫米KH ₂ PO _4，11.7毫米D -葡萄糖，氯化钙₂ 1.3毫米，10毫米的HEPES，pH值7.4）。 15 ml Eppendorf管中分别在两个混合每个原液2.1μL（10毫米CMFDA或CMRA），分别在碳酸氢克雷布斯HEPES缓冲液3毫升。这就产生了一个"加载的解决方案"，含有约7μMCMFDA（CMRA）。
4. 碳酸氢克雷布斯HEPES缓冲液冲洗细胞两次，然后插入装入烧瓶的解决方案。在5％的CO ₂孵育30分钟的细胞在37 ° C 。在这第一次的孵化试剂自由穿过细胞膜，但一旦进入细胞内，所用试剂均为转化为细胞impermeant荧光反应产物。
5. 第一潜伏期后，冲洗和孵化与另外两个小时的细胞培养液中，在_5％的CO 2在37 ° C。
6. Trypsinize两个烧瓶中的细胞（CMFDA和CMRA加载）和混合红色和绿色的细胞在50 mL离心管中的比例为1:1（TPP，ZDA）。调整细胞浓度5 × 10 ⁶细胞/毫升DMEM培养基稀释或浓度与离心机。将一个细胞悬液20μL每孔24多孔板（TPP，ZDA）下降。 5％的CO ₂孵育细胞在37 ° C时20分钟，让他们稍微井表面的重视，并建立细胞接触。

二。电熔

1. 准备isoosomolar钾磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾10毫米，10毫米K ₂ HPO _4，1MM氯化镁_2，250毫米蔗糖）和hypoosmolar钾磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾10毫米，10毫米K ₂ HPO _4，1MM MgCl _2的 ，75毫米蔗糖） 。
2. 到细胞在显微镜阶段，位置在井底部的电极放置多孔和它们连接到脉冲发生器。
3. 1毫升的isoosomolar磷酸钾缓冲液洗细胞。新增350 hypoosmolar钾磷酸盐缓冲液，以诱导细胞肿胀。缓冲区应覆盖的电极。
4. 留在细胞应用电脉冲前2分钟hypoosmolar缓冲。在此期间的水分子进入细胞，由于细胞内部和外部之间的渗透压不平衡的时间涌入导致细胞体积增大。电脉冲应适用于当细胞接近其最大卷，监管量减少启动前。
5. ，为了达到最佳的电熔，并保持细胞活力，应使用最佳参数的电脉冲。这取决于使用[1]的细胞株。 8矩形脉冲（每100μs的时间在1 Hz）的列车在这个实验中是适用于每个样本，使用电设备（我们的情况下Cliniporator，Igea酒店，意大利）。该脉冲传递到两条平行的Pt / Ir电极丝与它们之间的0.8毫米直径5毫米的距离，创造约1200 V /厘米，每孔的电极之间的电场，除了控制好。
6. 保留10分钟后，脉冲传递不受干扰细胞。确定的荧光灯和相衬显微镜融合产量。

三。图像采集和融合产量测定

1. （在我们的例子中，德国蔡司ZEISS AXIOVERT 200）配有一个客观的（X20）和一个冷却CCD相机（VisiCam 1280 Visitron，德国）荧光显微镜观察细胞。图像采集MetaMorph 7.1.1分子器件，（美国），但也可用于其他类似的数据采集软件。在548 nm处，在492 nm处的单色（多彩四，Visitron，德国）和CMRA CMFDA是兴奋。 CMFDA和CMRA荧光收购使用两个排放过滤器，一个为535 nm为中心（HQ535/30m，CMFDA）和其他中心在510 nm（D605/55m，为CMRA的，无论是色度，美国）。分色镜（Q515LP）的使用，阻碍了通道串扰。
2. 每口井的5个随机选择的领域获得三幅图像（相衬，红色和绿色荧光）。创建每个图像三重的三个通道的图像。在这样的图像可以看出荧光细胞质与细胞膜一起。融合细胞，因此可以很容易地确定[图1]。
3. 所有三种类型的细胞（红色，绿色和双重荧光）计数在每三个通道的图像。确定每幅图像中的所有细胞数量的双重荧光的细胞数量除以的双重荧光细胞的百分比。融合率被定义为百分比乘以2的双重荧光细胞，因为融合细胞的一半都没有检测到（当相同颜色的保险丝细胞）。

代表性的成果

图1三通道B16F1细胞电融合后的显微镜图像 。相衬，CMRA荧光（在548 nm的激发）和CMFDA荧光（492 nm处的激发） ，物镜20X

Discussion

非特异性，如外部电场，细胞膜的融合能力是非​​常重要的生物技术，医学和生物学研究。这种非特异性的融合，使非常宝贵的杂交细胞和他们的产品，如单克隆抗体，的生产，并提供信息融合[2]的基本机制。电熔是一个潜在的非常有效的方法，因为它可以适当调整不同类型的细胞。电熔时细胞在亲密的身​​体接触到他们fusogenic的国家带来的（容易融合）通过高压电脉冲。电熔效率取决于影响的电熔过程中的两个部分的各种参数。电熔过程中的第一部分，是实现细胞之间的密切的身体接触，可以用不同的方法获得的[3-8]。坚持的方法（生长期的细胞汇合），可以有效地使用，由于在自发设立的大区之间的细胞的细胞接触，但是，它会产生非常大，许多核细胞融合。我们使用的是修改后的坚持方法，较小的细胞（2至5原子核），这是更容易存活和增殖，获得（图1）。细胞之间的联系也有利于从细胞的渗透压肿胀，由于渗透压的治疗实验[9]中使用。电熔过程中的第二部分，是实现fusogenic状态的细胞膜。 Fusogenic国家相互关系以及与electropermeabilized膜状态的细胞都是非，特别通透，通常可以不通过通过完整的膜的分子和的电脉冲（振幅，长度，数量和频率）的相同参数管[10] 。最佳电所需的电气参数值[1]和电熔差异不同的细胞，取决于细胞的大小和其生物学特性。电气参数，因此需要不同的细胞系，这是用来作为融合伙伴，获得融合优化。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMRA	试剂	Invitrogen	C34551	胞质荧光染料
CMFDA	试剂	Invitrogen	C7025	胞质荧光染料
DMSO	试剂	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	试剂	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基
胎牛血清	试剂	Sigma-Aldrich	F4135
L-谷氨酰胺	试剂	Sigma-Aldrich	G7513
晶体西	试剂	Pliva	625110	抗生素
庆大霉素	试剂	Sigma-Aldrich	G1397	抗生素
Hepes	试剂	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	试剂	Merck & Co.， Inc.	A124873 927
KH2PO4	试剂	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	试剂	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	试剂	Fluka	71382
KCl	试剂	Merck & Co.， Inc.	A154336 908
MgSO4	试剂	Sigma-Aldrich	M2643
D-葡萄糖	试剂	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	试剂	Sigma-Aldrich	C4901
蔗糖	试剂	Sigma-Aldrich	16104
电脉冲发电机	工具	IGEA		Cliniporator VITAE
多孔板	工具	Techno Plastic Products	92424
50 ml 离心管	工具	Techno Plastic Products	91050
15 ml 离心管	工具	Techno Plastic Products	91015
25 cm2 培养瓶	工具	Techno Plastic Products	90026
电极	工具	定制		Pt/Ir