人类精子中Ca2+信号成像技术

摘要

通过刺激诱发单个精子的[Ca²⁺]i信号变化进行评估。将具有运动能力的精子细胞用Ca²⁺敏感型荧光染料（AM酯法）负载后，固定于可灌流的腔室中。利用时间推移荧光显微镜对细胞成像，并通过灌流介质施加刺激。单个细胞（或特定区域）的反应通过Excel软件进行离线分析。

摘要

荧光显微镜观察加载了荧光 Ca²⁺-sensitive 荧光染料用于测量 Ca²⁺ 的空间和时间动态变化²⁺活细胞中的信号传导。在这里，我们描述了在我们的实验室中用于将人精子悬浮液负载Ca²⁺-reporting染料，并在生理刺激期间测量荧光信号。运动细胞通过直接上泳法分离，并根据实验需要在获能条件下孵育0–24小时。细胞可渗透的AM（乙酰氧基甲基酯）酯形式的Ca²⁺-reporting染料被加入到一份细胞等分试样中，并给予1小时的孵育时间，使染料进入细胞质。我们使用可见光波长的染料以尽量减少对细胞的光损伤，但这意味着无法进行比率测量记录。本文讨论了该方法的优缺点。在染料孵育期间，将细胞引入成像腔室，并使其贴附于经聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上。孵育结束后，通过将腔室连接至灌流装置，去除多余的染料和未贴壁的细胞。腔室持续灌流，刺激物和改良盐溶液随后被加入灌流液储液槽中。实验通过时间序列采集荧光图像进行记录，并在离线状态下进行详细分析，通过手动绘制感兴趣区域完成。数据被标准化为刺激前水平，从而对每个细胞（或细胞的某一部分）生成显示Ca²⁺以荧光变化百分比的形式获得响应。

方案

精液分析正常的健康生育男性提供的精子，通常按以下方法进行成像前准备。

1. 精液样本在37°C下保存不超过30分钟。通过游走法将细胞从精浆中分离至添加补充物的Earle's平衡盐溶液（sEBSS；mM：1.8 CaCl₂·2H₂O，5.37 KCl，0.81 MgSO₄·7H₂O，26.2 NaHCO₃，1.0 NaH₂PO₄·2H₂O，116.4 NaCl，55.6 D-葡萄糖，2.73 丙酮酸钠，41.8 乳酸钠）中，该溶液添加了0.3%去脂/无脂肪酸的炭吸附Fraction V BSA（BSA的质量对精子获能的成功至关重要）。将1 ml sEBSS移液至一系列5 ml离心管中，每管轻柔地在其下层加入0.3 ml精液。在37°C、6% CO₂条件下孵育1小时后，小心吸取每管上层0.7 ml液体并合并。取10 μl精子悬液与90 μl 1%（v/v）甲醛混合以固定细胞，随后在Neubauer计数板中计数精子。然后用sEBSS将悬液中的细胞密度调整至600万个细胞/ml。
2. 将样本分装至松盖离心管中，每管200 μl，并在37°C、6% CO₂条件下孵育5–6小时，以完成精子获能。
3. 盖玻片（22×50 mm）预先用聚-D-赖氨酸处理。将10 μl聚-D-赖氨酸溶液（10% w/v）以数个小液滴形式滴加至盖玻片中央，随后让其自然风干。此过程可在加热台上进行，必须完全干燥。使用真空脂将盖玻片固定于一个封闭式、特制的、可灌流的聚碳酸酯成像室（尺寸为35 mm × 20 mm × 5 mm，容量约180 μl），类似于Warner RC20型灌流室。当在倒置显微镜下观察细胞时，聚-D-赖氨酸包被的盖玻片构成成像室的底部，而一个直径为12 mm的圆形盖玻片则作为成像室的顶部，以允许光线透过。
4. 使用Oregon Green BAPTA1-AM（OGB）或Calcium Green 1-AM对细胞进行标记。OGB通过溶于DMSO制备。在DMSO中加入Pluronic酸F127（一种去垢剂）以防止染料“聚集”。该溶液可于实验前在实验室中现配（100 mg Pluronic溶于0.5 ml DMSO），也可购买预混制剂。将20 μl该溶液加入50 μg OGB（2.5 mg/ml）的分装管中。该试剂管可冷冻保存，使用时再解冻。
5. 精子获能完成后（在sEBSS中37°C、6% CO₂条件下孵育5–6小时），选取一管用于成像，加入1.2 μl OGB溶液，终浓度为10 μM。继续孵育40分钟，随后用P1000（蓝色）移液枪头将细胞悬液轻柔注入成像室的进液口。将成像室放入孵箱中，聚-D-赖氨酸包被面朝下，孵育20分钟。细胞倾向于沿成像室表面游动，并附着于聚-D-赖氨酸包被区域。
6. 将成像室安装至显微镜载物台上，连接灌流装置，并以约0.5 ml/min的速度进行灌流。滚轴泵将生理盐水送入成像室，出液口的溢出液由带捕集装置的抽吸泵移除。在暗处静置至少10分钟，通过灌流去除未贴壁的细胞和细胞外染料。温度稳定性至关重要，因为微小的温度波动不仅可能影响细胞内Ca²⁺稳态，还可能影响染料的K_d值。实验通常在25°C下进行，通过将暗室温度维持在该水平实现。我们发现，将房间温度控制在所需水平，比使用温控载物台或在盐水进液管路上安装恒温加热器，能提供更佳的温度和聚焦稳定性。
7. 在相差显微镜（40倍或60倍油镜）下观察细胞，并选择成像区域。优先选择靠近进液口的聚-D-赖氨酸包被区域，此处盐水流动呈层流且稳定。同时应选择细胞密度适中的区域（密度过高会因邻近细胞信号干扰而影响数据质量和完整性），且细胞附着良好但鞭毛活动仍可辨识的区域。保存一张相差图像。随后切换至荧光模式（激发波长480 nm，发射波长540 nm），并将曝光时间缩短至获得清晰荧光图像所需的最低值（通常为50–200 ms）。
8. 通过启动时间序列图像采集软件（IQ）开始实验。通常以0.1 Hz频率采集图像，并仅在图像采集期间通过软件控制的快门开启照明。虽然可使用更高的采集速率，但必须考虑光漂白及光损伤导致伪影的问题（见讨论部分）。IQ（及其他大多数采集软件平台）可在实验过程中实时绘制荧光强度变化曲线。
9. 在3–5分钟的对照期后，通过更换灌流储液瓶中的生理盐水来调节盐水成分（如[Ca²⁺]_o）或施加药物。记录每次刺激物添加的时间，以便计算其到达成像室的时间，对于本实验中描述的缓慢反应（采样频率0.1 Hz）已具备足够准确性。若需研究更快速的反应，可通过Warner RC20灌流室所配备的第二个进液口直接将刺激物加入盐水流动路径，从而获得更高时间精度。
10. 使用IQ软件离线分析图像。围绕每个细胞（或细胞部分）划定感兴趣区域（ROIs），同时选择一个无细胞区域（用于软件自动背景扣除）。随后检查图像序列，剔除在实验过程中死亡或发生顶体反应的细胞（顶体反应表现为荧光迅速大幅增强，随后胞质染料丢失），以及因移动明显而在时间序列分析中产生伪影的细胞。
11. 对每个ROI获取时间-荧光强度曲线，然后在Excel中离线分析这些数据。首先将荧光强度归一化为对照期的平均值，使用公式 R = [(F - F_rest) / F_rest] × 100%，其中R表示相对于对照期的荧光变化百分比，F为时间t时的荧光强度，F_rest为对照期内至少30次F值测定的平均值。

代表性结果

图1显示了一系列细胞经3 μM孕酮刺激的实验图像。上排图像及视频1以灰度显示荧光图像，下方图像（及视频2）则以伪彩（Image J中的“16_colors”查找表）显示相同图像，其中“冷”色调表示荧光强度较低，“暖”色调表示荧光强度较高。实验过程中可使用IQ软件中的查找表实时以伪彩观察细胞，但通常使用灰度图像更有利于判断细胞标记是否良好。前两幅图像分别在开始记录后的0 s和100 s采集。荧光信号应保持稳定，且在顶体后区和精子颈部区域通常最强。孕酮约在175 s时进入成像腔，随后的3^rd 和 4^th 图像（180 s 和 220 s）显示 [Ca²⁺]ⁱ （荧光）起源于细胞后部头部和颈部区域。后续图像分别在290、360、740、990和1440秒时采集，显示初始[Ca²⁺]i 瞬时升高及继发的持续性升高。图2展示了电子表格分析结果，将每个ROI的原始荧光值转换为标准化荧光值（与对照期相比的荧光变化百分比）。图3显示了3个细胞在3 μM孕酮刺激下呈现“典型”反应的时间归一化荧光曲线图。

图 1. 用黄体酮刺激细胞的示例数据。上排为灰度荧光图像序列，下排为伪彩图像序列。时间点分别为 0、180、220、290、360 和 990 秒。3 μM 黄体酮于 175 秒时进入成像室。第一张图中显示了感兴趣区域（ROIs）。

图 2. 在 Excel 中对单细胞荧光数据进行分析。黑色数字为垂直排列的荧光数据时间序列。下方红色数字为使用文中所给公式获得的归一化数据。该图显示了本实验中细胞 64 的归一化荧光-时间曲线，在受到刺激后，荧光信号出现短暂上升，随后为缓慢上升及一系列小幅振荡。

图3. 3个单细胞的荧光-时间轨迹，以相对于对照值的百分比变化表示。在箭头标记的时间点加入3 μM孕酮。虚线表示对照荧光的平均值。

讨论

若操作成功，该技术可用于记录人类精子中自发性和诱导性 Ca²⁺ 信号的分布与动力学特征。可从大量细胞（最多达 200 个）中获得反应结果，这一点至关重要，因为人类精子在自发性和刺激诱导的 Ca²⁺ 信号方面存在较大个体差异。标记的成功率以及记录过程中细胞的存活情况在很大程度上依赖于样本质量。质量较差的样本会导致标记效果不佳、反应微弱，且细胞可能在记录过程中死亡。

人类精子对光损伤非常敏感，因此我们采用最低必要的光照（包括强度和曝光时间），以最大限度地提高细胞存活率，并减少因细胞死亡导致的人工假象。高灵敏度相机（允许使用低强度照明）具有显著优势，因为它能够检测到微弱的荧光信号。背照式电子倍增CCD（EM-CCD）相机尤为适用，尽管价格昂贵。使用LED照明（替代配备激发滤光片的氙灯或汞灯）也有助于提高细胞存活率（Nishigaki 等，2006）。

尽管比率成像具有明显优势，但我们并未使用Fura-2，因为Fura-2需要紫外光激发，且每次测定比率均需采集两幅图像。对于使用单波长可见光染料获得的数据，荧光强度的归一化可在很大程度上补偿不同细胞间染料负载量的差异，但无法校正单个细胞内染料分布的不均一性，这一点必须予以注意。虽然原则上单波长染料可以进行校准，但该技术的准确性较差，因此我们不尝试进行此类校准。

尽管使用 Fura-2（或发射比值染料 indo）获得的比值数据即使未经校准，也能较为真实地反映[Ca²⁺]i的相对变化，但单波长染料的荧光强度与[Ca²⁺]i之间的关系远非线性。在饱和曲线最有用的部分，单波长染料的响应通常近似呈对数关系。目前我们使用俄勒冈绿 BAPTA-1（图4），因为它对接近静息水平（50–100 nM）的[Ca²⁺]i微小变化具有较高敏感性。当[Ca²⁺]i上升超过1 μM时，荧光变化将低估实际响应，且染料可能达到饱和。在不采用紫外激发的前提下，改进该技术的一种方法是使用如Fluo-3和Fura Red等染料对细胞进行双重负载。这两种染料均可在488 nM处被激发，但其响应特性截然不同。在540 nM和650 nM处同时记录发射光信号，可获得比值，从而为[Ca²⁺]i的精确监测提供更优方法（Haughland, 2002），该方法也可能适用于精子研究（Nisigaki et al, 2006）。

图4. Oregon Green BAPTA-1 和 Oregon Green BAPTA-2 在游离 [Ca²⁺]（nM）与峰值波长处荧光发射（约525 nm）之间的关系。OGB1 在静息 [Ca²⁺] 下产生更强的荧光，但在较低浓度即达到饱和，因此可用范围较小。这些曲线的数据来源于 Molecular Probes 手册（Haughland, 2002）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低光照相机	QImaging	Rolera XR
俄勒冈绿 BAPTA-1	Invitrogen	06807
成像软件	Andor	IQ
成像软件	美国国立卫生研究院	Image J	公共领域软件
LED 照明系统	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127（DMSO 中 20% 溶液）	Invitrogen	P3000MP