基于GFP的荧光 体内 分别定量哺乳动物细胞中同源重组和非同源末端连接的检测方法
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摘要
摘要
DNA双链断裂是最危险的DNA损伤，可能导致大量遗传信息丢失和细胞死亡。细胞通过两条主要途径修复双链断裂：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。NHEJ和HR的异常通常与早衰及肿瘤发生相关，因此建立定量检测每种双链断裂修复途径的方法具有重要意义。本实验室开发了荧光报告载体，可实现对NHEJ和HR的灵敏且定量的检测。这些载体基于一个经过改造的GFP基因，其中包含一种罕见切割的I-SceI内切酶识别位点，用于诱导双链断裂。初始载体不表达GFP，因为GFP基因被插入的额外外显子或突变所失活。当I-SceI诱导的断裂通过NHEJ或HR成功修复后，可恢复GFP基因的功能。通过流式细胞术计数GFP阳性细胞的数量，即可定量评估NHEJ或HR的修复效率。
方案
在本方案中，我们描述了利用染色体整合报告系统分析DNA双链断裂修复的方法1,2 其中诱导了双链断裂（DSBs） 体内 通过瞬时表达稀有切割内切酶 I-SceI3整合性检测方法具有在染色体环境中分析DNA双链断裂修复的优势。然而，该方案需要长时间的细胞传代，这在使用原代细胞时可能存在问题。
一种替代方法是染色体外检测，其中报告基因载体被消化 体外 使用 I-SceI 或 HindIII 内切核酸酶进行消化，然后作为线性 DNA 转染入细胞。胞外染色体检测方案4 与下文所述的整合检测方法类似，但有以下修改：对于染色体外检测，省略报告基因构建体的整合步骤，改为将报告基因构建体与细胞共转染 0.5 μg NHEJ 报告质粒线性化 体外 用 I-SceI 或 HindIII 消化 0.1 μg 以pDsRed2-N1作为转染对照。进行HR实验时共转染 2 μg 用 I-SceI 或 HindIII 线性化的 HR 报告质粒 0.1 μg pDsRed2-N1。转染后三天通过流式细胞术分析细胞。染色体外检测可实现对原代分离细胞中DNA双链断裂修复的分析，避免了频繁的细胞传代，并有助于多种细胞系的分析。
1. 用于NHEJ和HR的报告基因构建体
NHEJ 报告基因盒5包含一个带有来自 Pem1 基因的人工 3 kb 内含子的 GFP 基因（GFP-Pem1）。Pem1 内含子包含一个腺病毒外显子，其两侧为 HindIII 和 I-SceI 核酸内切酶的识别序列（图 1a），用于诱导双链断裂（DSB）。I-SceI 位点呈反向排列。I-SceI 具有非回文的识别序列，因此两个反向位点可产生不相容的 DNA 末端（图 1c）。不相容的 DNA 末端最能模拟自然发生的双链断裂。完整的 NHEJ 报告基因盒不表达 GFP，因为腺病毒外显子破坏了 GFP 的开放阅读框（ORF）。当 I-SceI 诱导产生双链断裂后，腺病毒外显子被切除，NHEJ 修复机制恢复 GFP 基因的功能（图 2）。该 NHEJ 报告系统的独特之处在于，由于内含子可耐受缺失和插入，因此能够检测广泛范围的 NHEJ 事件。
HR 报告基因盒1（图1b）同样基于 GFP-Pem1。在 HR 报告基因盒中，GFP-Pem1 的第一个外显子包含一个 22 bp 的缺失，并插入了三个限制性酶切位点 I-SceI/HindIII/I-SceI。该缺失确保 GFP 无法通过 NHEJ 事件恢复功能。两个 I-SceI 位点呈反向排列，因此经 I-SceI 酶切后产生不兼容的末端（图1c）。第一个 GFP-Pem1 拷贝之后接有一个无启动子且无起始密码子（ATG）的 GFP-Pem1 第一外显子及内含子。完整的构建体不表达 GFP。当 I-SceI 酶切诱导产生双链断裂（DSB）后，通过两个突变型 GFP-Pem1 第一外显子之间的分子内或分子间基因转换，可重建有功能的 GFP 基因。由于第二个 GFP 基因拷贝缺少第一个 ATG 密码子和第二外显子，因此发生交换或单链退火不会恢复 GFP 活性。该设计可特异性检测基因转换事件，而基因转换是哺乳动物细胞中主要的同源重组（HR）通路（图3）。
2. 报告基因载体的基因组整合
- 制备高质量的NHEJ或HR报告质粒。为获得最佳结果，建议使用Qiagen Endo Free试剂盒。通过260/280 nm处的吸光度测定质粒浓度和纯度。
- 用50 U NheI在50 μl（反应总体积）中于37°C孵育6小时，线性化10 μg报告质粒（请勿使用干式恒温块，以防止蒸发）。使用Qiagen QiaexII试剂盒从消化液中纯化DNA，并将DNA洗脱至20 μl 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。通过260/280 nm处的吸光度测定DNA浓度和纯度。通常在纯化过程中会损失20–30%的DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测少量等分试样（2 μl），并与未消化的报告质粒对照，以确认消化效率和产量。纯化后的线性化报告质粒可保存于–20°C。
- 为转染做准备，使细胞处于最佳生长状态。若从冻存管开始培养，应在转染前传代两次；若从汇合度较高的培养皿开始，则传代一次即可。
- 将细胞培养至70–80%汇合度（通常需要两天时间，以正常人成纤维细胞为例，接种量为5×105个细胞/100 mm培养皿）。为获得最佳转染效率，必须使细胞处于对数生长期。活跃生长的培养物中含有处于M期的细胞（表现为贴附于表面的圆形细胞）。
- 按照制造商推荐方案，使用Amaxa Nucleofector进行细胞转染。对于成纤维细胞，使用NHDF溶液和程序U20。转染时，从两个100 mm培养皿中收集细胞（约2×106个细胞）。消化过程中切勿过度胰酶处理。一旦80%的细胞从培养皿脱落，即刻终止消化。将细胞重悬于NHDF溶液中。细胞对NHDF溶液较为敏感，因此应尽量缩短孵育时间，并轻柔混匀。使用0.5 μg线性化的报告质粒进行转染。该转染条件应用于正常人成纤维细胞时，大多数整合子可实现报告质粒单拷贝整合。
- 转染24小时后，加入1 mg/mL遗传霉素（G418），筛选染色体上整合有报告质粒的细胞。持续筛选7–10天。
- 挑取G418抗性克隆（可挑取单个克隆或合并抗性细胞克隆）。将培养物扩增至约五个100 mm培养皿。冻存其中三个培养皿以备后续使用，其余两个继续扩增至所需细胞数量（通常十个100 mm培养皿足以支持五次转染）。
- 当细胞达到70–80%汇合度时（成纤维细胞接种5×105个细胞/100 mm培养皿后约两天），即可进行I-SceI表达质粒的转染。
3. 通过瞬时表达 I-SceI 核酸内切酶诱导 DSB
- 使用 Amaxa Nucleofector（成纤维细胞采用 NHDF 溶液和 U20 程序），将约 2×106 个处于对数生长期的细胞（两个培养皿）与含有 5 μg I-SceI 表达质粒和 0.1 μg pDsRed2-N1（Clontech）的混合物共转染，其中 pDsRed2-N1 作为转染效率对照。
- 同时，为流式细胞术（FACS）准备三个校准对照：将约 2×106 个细胞分别转染以下质粒：(i) 5 μg EGFP 表达质粒；(ii) 5 μg pDsRed2-N1；(iii) 5 μg 不表达荧光蛋白的对照质粒（我们使用编码 HPRT 小基因的质粒）。
- 将细胞培养四天，以提供足够时间使 GFP 和 DsRed 蛋白表达。
- （可选）转染后第三天，使用配备 GFP 和 DsRed 检测滤光片的荧光倒置显微镜，验证转染效率及 GFP 和 DsRed 蛋白的表达情况。
4. 通过流式细胞术分析 GFP+ 和 DsRed+ 细胞
- 转染后第四天，收集 I-SceI 转染细胞和对照细胞。用 500 μL PBS 重悬细胞，并将细胞转移至 FACS 管中。此步骤的关键是收集全部细胞，并确保细胞呈圆形。为此，建议使用更长的胰蛋白酶消化时间或更强效的胰蛋白酶。在显微镜下观察，确认 99% 的细胞已从培养板上脱落并呈圆形。将细胞置于冰上并避光保存（用铝箔覆盖冰桶）。细胞可在冰上保存数小时。为获得最佳结果，建议在收获后立即进行分析。
- 使用 GFP、DsRed 及阴性对照对 FACS 进行校准。调节电压和荧光补偿，以确保所有荧光细胞均被纳入分析范围（图 4）。需注意，实验样本的荧光强度将低于对照样本。
- 通过 FACS 分析 I-SceI 转染细胞。每种处理条件至少计数 20,000 个细胞。为避免 GFP 与 DsRed 荧光之间可能的干扰，建议将 GFP+ 或 DsRed+ 细胞的比例控制在 25% 以下。若 DsRed+ 或 GFP+ 细胞比例过高，可减少 pDsRed2-N1 或 I-SceI 质粒的用量。在我们的实验中，仅需调整 pDsRed2-N1 质粒的用量，而无需调整 I-SceI 质粒的用量。
- GFP+ 细胞的百分比代表 DNA 双链断裂（DSB）修复效率，DsRed+ 细胞的百分比反映转染效率。通过计算 GFP+ 细胞与 DsRed+ 细胞的比值，得出 DNA DSB 修复的相对效率。
- 可对修复后的末端连接序列进行测序，以检测修复的准确性。报告基因构建体包含 E.coli 复制起点和卡那霉素抗性基因（图 1）。这使得可通过 EcoRI 酶切基因组 DNA、环化连接并转化至感受态 E.coli 细胞中，从而回收构建体。随后通过限制性酶切和测序分析回收的质粒。
5. 典型结果
对照转染以及NHEJ和HR实验的典型FACS结果分别如图4和图5所示。由于这些细胞中GFP和DsRed构建体的拷贝数不同，转染I-SceI并含有整合型NHEJ和HR构建体的细胞（图5）相比对照组（图4）其荧光强度和荧光阳性细胞数量均较低。本实验中每个细胞仅含一个拷贝的整合报告构建体，因此在部分细胞中成功的修复事件将恢复GFP基因的功能。在人成纤维细胞中转染0.1 μg pDsRed2-N1可实现每细胞约1个质粒拷贝的递送。
NHEJ 和 HR 的效率通过 GFP+/DsRed+ 细胞的比例来计算。在人类细胞中，NHEJ 是比 HR 更高效的修复过程2。在人类成纤维细胞中，NHEJ 的效率通常为 0.6–1.3，HR 的效率为 0.05–0.3。由于 DSB 修复效率是通过 GFP+/DsRed+ 细胞的比例来测定的，因此 I-SceI 与 DsRed2-N1 质粒混合物的比例变化可能会影响实验结果。质粒质量也可能通过影响转染效率而改变实验结果。因此，为了获得一致的测量结果，实验中应使用相同的质粒混合物。此外，DSB 修复效率还受到细胞类型、细胞周期时相以及整合构建体染色体位置的影响。
图1. 用于分析NHEJ（A）和HR（B）介导的DNA双链断裂修复的报告系统构建体。（C）由两个反向排列的I-SceI位点经酶切后产生的不兼容性DNA末端。 SD，剪接供体；SA，剪接受体；阴影方框，多聚腺苷酸化位点；Neo/Kana，由两个启动子调控的单个开放阅读框：SV40 在哺乳动物细胞中赋予新霉素抗性；β-内酰胺酶在大肠杆菌（E. coli）中赋予卡那霉素抗性；Ori， 大肠杆菌 pUC 复制起点
图2. 用于分析NHEJ的报告基因构建体。 在该构建体中，GFP基因处于失活状态；但当发生双链断裂（DSB）并成功通过NHEJ修复后，构建体将变为GFP阳性。下方展示的是该报告基因通过NHEJ修复后的产物。
图3. 通过基因转换分析同源重组的报告系统构建。 当I-SceI诱导产生双链断裂（DSB）后，通过基因转换（GC）的同源重组可重建一个有活性的GFP基因。下方显示了该报告系统经主要DNA修复途径修复后的产物：基因转换（GC）、交换（X-over）、单链退火（SSA）和非同源末端连接（NHEJ）。图中所示X-over修复产物为分子内重组结果；分子间重组将产生相同的产物，但位于一条染色体上。表达有活性GFP蛋白（GFP+）的基因以绿色表示。
图4. FACS分析参数的校准。 （A）转染pHPRT质粒的成纤维细胞，作为阴性对照以排除自发荧光细胞。（B）转染pEGFP质粒的成纤维细胞，用于设定GFP+细胞的门控（绿色区域）。（C）转染pDsRed2-N1质粒的成纤维细胞，用于设定DsRed+细胞的门控（红色区域）。
图 5. 在携带染色体整合报告构建体的正常人成纤维细胞中分析 NHEJ（A）和 HR（B）的典型结果。
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讨论
荧光NHEJ和HR报告基因检测为分别定量测量每种DSB修复通路提供了一种定量方法 体内检测灵敏度很高，因为流式细胞术能够可靠地在20,000个细胞中检测到10个GFP阳性细胞。该检测方法可进行调整，通过在诱导DNA双链断裂后数分钟至数小时内检测GFP阳性细胞的出现，实现对修复事件的“实时”监测。2此外，对GFP+细胞的分析不依赖于额外的细胞增殖，因此可在使用不同抑制细胞分裂的药物处理后，在细胞周期的不同阶段分析DSB修复。6这相较于基于可筛选标记物重建的报告系统构建具有重要优势。
NHEJ 过程本身容易出错，会在末端连接处产生各种小片段的重排。我们的 NHEJ 报告系统具有一个独特性质，即修复事件发生在一个内含子内部，而内含子能够耐受缺失和插入，从而允许检测广泛范围的 NHEJ 事件。HR 报告系统与 NHEJ 报告系统基于相同的改造后的 GFP 基因，因而可实现对 NHEJ 和 HR 的比较分析。利用荧光标记的 NHEJ 和 HR 检测方法将有助于哺乳动物双链断裂修复研究的开展。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
原始的GFP-Pem1由李磊博士惠赠。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）和艾利森医学基金会向V.G.和A.S.提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| 遗传霉素（G418） | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| 圆底管 | BD Biosciences | 352058 | FACS 管 |
参考文献
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
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重印与许可
