体内 离心 果蝇 胚胎

摘要

我们描述了一种在活体果蝇（Drosophila）胚胎中按密度分离细胞器的方法。将胚胎包埋于琼脂中并进行离心。该技术可沿胚胎的头尾轴方向实现主要细胞器的可重复分离。此方法有助于共定位实验，并可获得用于生化分析及移植实验的细胞器组分。

摘要

分离和纯化不同类型细胞内细胞器的一个主要策略是根据其浮力密度的差异进行分离。然而，在离心前细胞被破坏后，蛋白质和细胞器在此非天然环境中常常发生非特异性地相互黏附。本文描述了一种在完整、活体的Drosophila胚胎中按密度分离细胞器的方法。在细胞化之前的早期胚胎从群体培养笼中收集，通过50%次氯酸钠处理去除其外部卵壳。随后将胚胎转移至一小块琼脂平板上，并以尾端朝前的方式插入琼脂中的微小垂直孔洞中。将含有嵌入胚胎的琼脂板在3000g条件下离心30分钟。琼脂可支撑胚胎并使其保持固定的取向。离心后，用钝针将胚胎从琼脂中取出。

离心分离可将主要细胞器分层，形成在明场显微镜下清晰可见的分层结构。已有多种荧光标记物可用于验证活体胚胎中分层是否成功。与特定细胞器相关的蛋白质将在某一特定层中富集，从而显示共定位现象。各个分层可被分别回收，用于生化分析或移植至受体卵中。该技术适用于其他大型细胞中的细胞器分离，包括多种物种的卵细胞和卵母细胞。

方案

1）制备琼脂平板

概述：本实验方案使用琼脂平板进行两种不同的用途。首先，琼脂平板作为卵的收集表面；其中的苹果汁可刺激果蝇产卵。其次，在对平板进行离心时，嵌在琼脂中的胚胎能够保持固定的取向；因此需要足够高的琼脂浓度，以防止平板在离心过程中解体。为简便起见，两种用途均采用同一种苹果汁琼脂平板。

材料

• 琼脂（25 g）
• 蔗糖（25 g）
• 苹果汁（250 ml）
• 尼泊金M储备液（5 g 对羟基苯甲酸甲酯溶于50 ml乙醇中），用作防腐剂
• 培养皿：用于离心（60×15 mm），以及用于收集卵（60×15 mm 或 100×15 mm，根据步骤2中使用的果蝇饲养笼而定）

设备

• 加热板
• 两个锥形瓶

1. 在锥形瓶中，加入 25 g 琼脂和 750 ml dH₂O。在液体循环模式下高压灭菌 50 分钟。在此期间，准备苹果汁溶液（步骤 1.2）。
2. 在另一个锥形瓶中，加入 25 g 蔗糖和 250 ml 苹果汁。在加热板上加热（至约 55°C）以溶解蔗糖。然后加入 15 ml Nipagin M 溶液。避免高温，否则会导致 Nipagin 分解。
3. 当琼脂溶液冷却至可用手触摸锥形瓶时，将两种溶液混合并充分搅拌。在加热板上搅拌，直至混合均匀。
4. 将溶液倒入培养皿中（约 0.5 cm 高）。1 升溶液可制备约 100 个小型（直径 60 mm）或 40 个大型（直径 100 mm）培养皿。
5. 琼脂平板应在室温下干燥数小时或过夜，否则会过于湿润而无法使用。如需长期保存，应将其包裹（置于塑料盒或培养皿套中）后于 4°C 保存。

2）收集胚胎

概述：在发育的最初3小时（室温条件下），Drosophila 胚胎为单细胞结构（不包括位于后端的生殖细胞前体——极细胞）。当这些发育阶段的胚胎被正确取向后进行离心时，主要细胞器会沿卵的长轴按密度分离。在细胞化阶段，这个巨大的单细胞会转变为数千个小型细胞；而所采用的离心力不足以破坏这些已形成的细胞。因此，为了成功实现主要细胞器的分离，关键在于离心尚未完成细胞化的胚胎。

材料

• 苹果汁琼脂平板
• 酵母糊（将干酵母与水混合至花生酱状稠度）

仪器

• 果蝇培养笼：可购买商用产品（见下文）或自制¹

1. 将成年果蝇饲养在笼中，笼底附有苹果汁琼脂平板。应根据所用笼子的尺寸选择合适的培养皿大小。
2. 为开始收集卵，需准备一块新鲜的苹果汁琼脂平板，并在其部分区域覆盖酵母糊。果蝇以酵母为食；特别是酵母可为产卵提供必要的营养。琼脂中的酵母和苹果汁成分还能诱导果蝇产卵。
3. 更换新旧琼脂平板时，需将果蝇笼倒置，并轻轻在实验台面上敲击数次，使果蝇落入底部并短暂失去方向感。这可为你提供数秒时间快速取下旧琼脂板并更换为新的。该操作需要一定练习，具体细节取决于所使用的果蝇笼类型。
4. 雌性果蝇会将交配所得的精子储存在体内的贮精囊（spermathecae）中，并在需要时释放精子以完成卵子受精。当营养充足且不受干扰时，雌蝇通常在受精后不久即产卵，因此产卵时间可标记为受精时间及胚胎发育的起点。当环境条件不理想时，雌蝇可能在受精后延迟不同时间才产卵。为减少此类发育阶段判断错误的胚胎数量，建议丢弃工作日的首次收集样本（进行30至60分钟的“预收集”即可）。新鲜酵母的存在可促使雌蝇排出滞留的受精卵，后续收集的卵样本则主要为受精后短时间内产出的卵。
5. 根据所需胚胎发育阶段，收集卵的时间最长可达3小时。由于在室温下细胞化过程约在3.5小时后完成，因此更长的收集时间并无益处。对于常规实验，我们倾向于采用较短的收集时间（1小时或更短），以获得发育阶段更一致的早期胚胎。
6. 有时果蝇会粘附在酵母或琼脂平板表面，可用镊子将其移除。

3）去除胚胎的卵壳

概述：Drosophila 胚胎表面覆盖着两层保护结构：外层为由蛋白质构成的卵壳（chorion），内层主要由蜡质组成的卵黄膜（vitelline membrane）。这两层结构可保护胚胎免受机械损伤和干燥。卵壳具有两个突出结构（卵丝或称背侧附属物），在形态上清晰可见。在此步骤中，我们将通过将卵浸入50%次氯酸钠溶液（漂白剂）中去除卵壳。一旦去除卵壳，胚胎在透射光下会变得透明，便于挑选特定发育阶段的胚胎进行离心。由于卵壳还会干扰后续多种操作（例如第6步中的固定），提前去除卵壳将有助于后续实验的快速处理。

50% 的漂白剂处理将在几分钟内溶解卵壳，但不会损伤胚胎。卵黄膜可阻止漂白剂进入。我们将持续进行漂白处理，直至卵丝不再可见为止。随后，通过将胚胎与漂白剂的混合液倒入细小的筛网（由金属丝网制成的篮状筛）中，将胚胎与漂白剂分离。漂白处理时间绝不可过短。若过早洗去漂白剂，后续步骤（例如固定后去除卵黄膜）可能会受到影响。

材料：

• 装有50%次氯酸钠溶液（一体积去离子水与一体积漂白剂混合）的挤压瓶₂O 至一体积市售漂白剂
• 含去离子水的冲洗瓶₂O
• 纸巾

设备：

• 由不锈钢丝网片制成的自制金属篮。制作篮子时，从平板上裁下约 2 x 2 cm 的方形片，并在中间压出凹痕。
• 用于夹持金属篮的镊子
• 设置为透射照明的解剖显微镜

1. 将琼脂平板置于解剖显微镜下，通过透射 illumination 观察胚胎。务必识别卵丝结构（见图 2A）。
2. 向琼脂平板上喷洒 50% 次氯酸钠溶液，覆盖胚胎。偶尔轻轻晃动琼脂平板，使胚胎在次氯酸钠溶液中旋转。
3. 当卵丝结构不再可见时（通常在 3–5 分钟后，但时间可能因情况而异），表明卵壳已成功去除。
4. 下一步将使用金属丝网篮作为筛子，以分离胚胎与次氯酸钠溶液。用镊子夹取金属丝网篮，将其置于琼脂平板倒置的盖子上方。该盖子将作为容器，承接穿过金属丝网滴下的次氯酸钠溶液。
5. 将琼脂平板上的次氯酸钠/胚胎混合液倒入金属丝网中。
6. 若仍有大量胚胎残留在琼脂平板上，可喷洒去离子水（dH₂O）至平板，并将 dH₂O/胚胎混合液倒入金属丝网中。若大量胚胎溢入接液容器中，可将容器内容物再次倒入金属丝网中进行回收。
7. 将金属丝网底部轻触纸巾，吸去多余液体。然后用喷瓶向金属丝网喷洒 dH₂O，以冲洗残留的次氯酸钠。如上所述，可使用倒置的平板盖作为接液容器，回收可能被冲走的胚胎。为减少胚胎损失，可将喷瓶出水方向沿金属丝网篮边缘喷洒。需频繁吸去多余液体。
8. 重复此清洗步骤 5 至 10 次，直至完全去除次氯酸钠。若金属丝网仍有次氯酸钠气味，应继续清洗。

4）在琼脂中固定胚胎

概述：Drosophila 卵的长度（约 500 μm）远大于其宽度（约 180 μm）。为了在离心过程中实现细胞器最大程度且一致的分离，我们使胚胎定向排列，使其前端朝向旋转中心（图 1、3）。这样，所有胚胎中最轻的细胞内结构（脂滴）将聚集在前端，而密度极高的结构（卵黄成分）则聚集在后端附近。将胚胎插入琼脂糖苹果汁培养基的小型垂直孔中，前端朝上露出。琼脂可在离心过程中保持胚胎的固定朝向。

仪器：

• 持针器
• 钨针；将钨针反向安装于持针器中，使钝端外露，可用于操作胚胎
• P200 移液器
• 设置为透射照明的解剖显微镜
• 果蝇刷（用于分选成年果蝇的小型画笔）

材料：

• 曲拉通盐溶液 (TSS)：4 g NaCl，0.3 ml 曲拉通 X-100，用 ddH₂O 定容至 1000 ml（可配制成 10 倍浓缩储备液）

1. 用TSS将胚胎从金属网篮中冲洗至一个空的培养皿中。胚胎应沉入底部。将盛有胚胎的培养皿置于解剖显微镜下，通过透射 illumination 观察（胚胎形态应类似于图4所示）。
2. 使用 P200 移液器挑选所需发育阶段的胚胎，并转移至小型琼脂平板中。特定阶段可通过肉眼轻松识别（图4；更多细节见 ¹操作需迅速，因为胚胎在不断老化，且在TSS中浸泡过久（超过30分钟）可能影响其发育。
3. 用移液器和Kimwipe吸除大部分TSS。琼脂表面应略带湿润，以便推动胚胎；但培养皿表面不得有液体积聚，因为在离心过程中多余的液体可能导致胚胎从孔中滑出。
4. 用针在琼脂中胚胎所在位置附近垂直穿刺小孔。由于需要倾斜持针以便同时在显微镜下观察，因此很难做到完全垂直穿孔。针头轻微倾斜反而是有利的，因为这样会在孔的一侧形成轻微凹槽，使胚胎易于沿此滑入孔中。只需刺穿琼脂表面即可，因为琼脂足够柔软，一旦胚胎部分插入孔中，便可无损伤地进一步推入。
5. 确保识别胚胎的前端和后端，因为胚胎应以一致的方向推入孔中，通常为前端朝上。前端的卵黄膜具有一种特化的结构，即精孔（图2），精子在受精过程中由此进入。
6. 使用针的钝端，可轻推胚胎使其在琼脂上移动，并将其后端朝向已打孔的位置进行定向或调整。随后，推动胚胎前端朝向小孔。此时胚胎应可顺着打孔时形成的轻微凹陷顺畅滑入孔中。当胚胎逐渐倾斜上抬时，继续将其更深地推入孔内。
7. 当完全推入后，胚胎通常已基本呈垂直状态。若未达到垂直，可通过侧向轻推使已插入的胚胎进一步调整至垂直。只要孔洞不过大，胚胎的位置在离心过程中将由琼脂稳定固定。
8. 经过练习，每块载玻片可包埋100–250枚胚胎。所需胚胎数量取决于具体实验目的：若用于活体成像或作为移植实验的供体，则所需胚胎较少；若需对胚胎进行固定和免疫染色，则在离心后的处理过程中会损失一部分样本，因此起始时需使用较多胚胎。需注意，胚胎在封片过程中仍会继续发育，因此若需获取特定且狭窄的发育阶段，应尽量缩短整体封片操作时间。
9. 若有未包埋的剩余胚胎，用湿润的果蝇刷从培养皿中移除。将果蝇刷浸入液体（如1xTSS）中，然后在解剖显微镜下轻轻擦拭培养皿表面，收集残留胚胎，再将刷子重新浸入液体中，将胚胎从刷子上冲洗下来。

5) 离心与胚胎回收

概述：将培养板转移至 Sorvall RT7 Plus 离心机的摆动桶中，在 4000 rpm 条件下离心 30 分钟，相当于约 3000 g。离心后，用 TSS 覆盖培养板。用针头从琼脂孔中挖出胚胎，并通过移液器转移至适当的容器中。

设备：

• 持针器及针（同前）
• Sorvall RT7 Plus 离心机，配备 RTH750 转子和摆动桶，或同等设备²
• 用于透射照明的体视显微镜
• P200 移液器

材料：

• TSS

1. 将平板转移至离心机的摆桶中，琼脂面朝下。确保离心机已均匀平衡。
2. 离心设置：温度 = 4–10°C，转速 = 4000 rpm，时间 = 30 分钟。
3. 离心结束后，将琼脂平板再次置于解剖显微镜下，并用一层 TSS 覆盖平板。
4. 使用针的钝端将胚胎从孔中挖出。胚胎将在 TSS 中漂浮，但仍保持浸没状态。
5. 胚胎将明显呈现分层结构：前端为棕色帽状结构，中间区域透明，后端为深灰色区域（图 2、5A）。丢弃未显示清晰分层的胚胎。
6. 使用 P200 移液器将分层清晰的胚胎连同 TSS 转移至新的容器中，例如闪烁瓶或微量离心管，具体容器选择取决于后续应用。

6) 进一步处理

根据具体应用，胚胎将随后以不同方式进行处理。

1. 若需通过明场或落射荧光显微镜直接观察，应将胚胎转移至缓冲液中，置于载玻片上，并用22×22 mm、厚度#1.5的盖玻片封片，以18×18 mm、厚度#1的盖玻片作为间隔物。若进行长时间观察，可能需要用卤代烃油27替代缓冲液。
2. 若需固定胚胎，应在步骤5.6中将其转移至闪烁瓶中，并采用标准固定方法¹进行固定。这些方法通常使用正庚烷-甲醇乳剂并伴随振荡以去除卵黄膜。需要注意的是，对于经离心处理的胚胎，此去卵黄膜步骤的效率较低。因此，建议尽可能使用较多的胚胎，或手动去除卵黄膜¹。
3. 若胚胎将用于移植实验（例如，从离心后的胚胎中移除特定的细胞器层），则应将其转移至琼脂平板，并按照未离心胚胎的标准操作程序将胚胎固定在盖玻片上³。离心所诱导形成的分层结构可稳定维持数十分钟。

7）代表性结果

如果离心过程按预期进行，主要的胚胎细胞器将按密度分离²。例如，低密度的脂滴会聚集在前端；高密度的卵黄小泡则会聚集在后端（图1，2）。脂滴和卵黄小泡分别是脂质和蛋白质的储存细胞器。

通过解剖显微镜或复式显微镜下透射照明对活体胚胎进行肉眼观察，可确认密度依赖性分层现象。胚胎应呈现如图5A所示形态：脂滴在最前端形成一个致密的棕褐色层（即“脂帽”）；卵黄聚集则在胚胎后端形成深灰色区域。这两个深色层之间由一个宽阔的透明区隔开，该区域代表其他细胞器和细胞质。若胚胎在细胞化之后才进行离心，则分层现象将极不明显（如图5C所示）。

如果有落射荧光显微镜可用，可将这些活的、经离心的胚胎在紫外光激发下进行观察。在此条件下，卵黄会显示出强烈的蓝色自发荧光（图5B）。在胚胎后极处出现一层致密的自发荧光物质，表明离心成功，并可作为后端的标记。

需要注意的是，如果对胚胎进行固定处理，这些层次的外观将发生显著变化。例如，当胚胎经过标准的加热或甲醛固定，随后用庚烷-甲醇去除卵膜¹时，脂滴会变得半透明，脂质层在明场显微镜下呈现为灰白色、蓬松状，而非深棕色（图5D）。固定过程会部分或完全破坏卵黄的自发荧光，使其荧光强度显著减弱，甚至无法检测。

如果采用in-vivo离心方法以突出某一特定细胞器，则使用荧光标记物对该细胞器进行标记将有助于验证。例如，已有研究报道了靶向线粒体、内质网或高尔基体的YFP融合蛋白⁴。在经过离心处理的胚胎中，这些标记物会沿前后轴的特征性位置富集（图1）。最后，某些组蛋白融合蛋白可同时定位于脂滴和细胞核²，因此可用于标记这些细胞区室（图5 E, F），并可通过标记的细胞核数量来监测胚胎发育阶段。本段提及的表达上述标记物的果蝇品系可从布卢明顿Drosophila品系中心获取（http://flystocks.bio.indiana.edu/）。对于组蛋白H2Av，已有GFP和mRFP两种变异体可供使用^{5, 6}

图 1. 通过离心分离细胞器（改编自²）。定向胚胎经离心后出现明显的分层现象（明场）。主要细胞器沿前后轴（上为前，下为后）在特征性位置富集：脂滴（通过尼罗红染色在固定胚胎中检测）；内质网、高尔基体和线粒体（在活体胚胎中通过正文所述的YFP标记检测）；卵黄（通过自发荧光检测）。荧光图像通过共聚焦显微镜获取。

图2. 胚胎的示意图。

A. 带有卵壳及明显卵丝（背附器）的卵。由于卵壳不透明，卵呈现均匀的暗色。

B. 去除绒毛膜的卵。在前端（左侧）可见精孔。根据发育阶段的不同，位于卵黄膜内的胚胎呈现均匀的深棕色，或显示出多种结构。示例见图4。

C. 按本实验方案所述方向定位的离心胚胎。脂滴在精孔端聚集形成棕色的“帽状”结构；卵黄则在另一端或其附近形成灰色层。

图3. 实验流程示意图。左侧：去除绒毛膜的胚胎被放置在琼脂平板表面，并用针将其推入琼脂中的孔内。这种固定方式可使所有胚胎保持一致的方向，头部（前端）朝上。右侧：离心后，胚胎发生分层。在琼脂上覆盖TSS（蓝色），再用针从琼脂中回收胚胎。一旦悬浮于TSS中，即可用移液器吸取胚胎。

图4. 活体黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的明场图像，显示其在步骤4.1中将呈现的形态。胚胎呈标准朝向：前端在左，后端在右，背侧向上，腹侧向下。早期胚胎发育的延时录像包含于本实验方案配套视频中。

A. 卵裂期胚胎呈均匀棕色。此类阶段的胚胎最适合用于 体内 离心

B. 原肠胚胚胎具有清晰的边缘，各侧外观相似。这一清晰的周边区域部分是由于细胞核在质膜处的聚集，部分是由于卵黄囊泡和脂滴向内运输所致。 ⁷该透明边缘持续扩展，直至细胞化即将完成时。 ¹胚胎即使在细胞化结束前仍可通过离心法成功进行分层。 ⁸尽管卵黄和细胞核的分层不如卵裂阶段那样一致。

C. 细胞化后，胚胎呈现不对称形态；背侧与腹侧逐渐分明，并形成多种褶皱。图示胚胎处于原肠胚带早期延伸阶段。在此阶段，离心已无法有效分离主要细胞器。

图5. 经离心处理的胚胎。本图中所有胚胎均以前端朝上方向进行离心，并按此方向展示。

A. 成功离心后的胚胎明场图像。最前端的棕色层是由于脂滴聚集所致。靠近后端的宽灰色层是由于卵黄囊泡形成。卵黄层下方常出现一个来源不明的透明区域。卵黄层上方通常可见一个黄褐色区域，可能代表线粒体。可溶性蛋白质分布于脂滴与卵黄之间的透明层中²。

B. 图A中的胚胎在紫外光激发下通过落射荧光显微镜观察。卵黄特有的蓝色自发荧光有助于识别后端。

C. 在胚带伸长期（即细胞化之后）进行离心的胚胎。卵黄可能仍聚集在后端，但其他分层现象极不明显。

D. 成功分层且经热固定后的胚胎。脂滴层呈现白色絮状，而非未固定胚胎中的深棕色（如A图所示）。

E. & F. 表达His2Av-GFP的胚胎，通过共聚焦显微镜成像（改编自²）。E：在卵裂期进行离心；由于此时形成的细胞核较少，His2Av-GFP似乎仅标记脂滴层。根据焦平面的不同，细胞核可能位于脂滴层下方附近（本图未显示）。F：在囊胚期进行离心；His2Av-GFP同时标记脂滴层（顶部）和细胞核（位于脂滴层下方的较宽区域内）。

讨论

关键步骤

确保琼脂浓度足够高。 如果浓度过低，琼脂在离心过程中会解体，导致胚胎破裂或方向紊乱。如果琼脂浓度略低，或琼脂过湿（在步骤 4.3 中干燥不充分或未充分去除多余的 TSS），胚胎会在离心过程中从孔中浮出，造成方向不正。如果琼脂铺得过薄，在离心过程中也会塌陷或开裂。

确保胚胎未发育超过细胞化阶段。 否则，细胞器的分离将无法进行（图5C），因为细胞器会被封闭在成千上万个独立的细胞内。在单细胞阶段的较年轻胚胎中，细胞器可自由长距离迁移，并根据其特征密度进行富集。为避免分析过老的胚胎，需确保做到以下几点：（i）进行预收集以使雌蝇产掉陈旧卵（步骤2.4）；（ii）收集胚胎时间不超过3小时（步骤2.5）；（iii）在包埋琼脂前肉眼挑选处于细胞化阶段之前的胚胎（步骤4.2）；（iv）缩短包埋时间，防止胚胎发育至细胞化结束（步骤4.6）；（v）弃去分层不正确的胚胎（步骤5.6）。

切勿缩短离心时间。 尽管部分胚胎在仅离心10分钟后即可显示出良好的分层效果，但不同胚胎之间的分离效果不一致。离心30分钟可获得高度一致的结果。此外，离心时间越长，离心结束后各层的稳定性也越持久。这对于那些在使用前需要较长时间进一步处理胚胎的应用尤为重要（例如，若胚胎需用于移植实验或制备共聚焦显微镜分析样品）。

可能的修饰

卵的收集与卵壳去除 针对步骤 2 和步骤 3，存在多种不同的实验方案^{1, 3, 9}，只要所使用的胚胎处于早期发育阶段、产卵量高且发育阶段错误的胚胎比例尽可能低，这些方案均可获得与本文所述相当的效果。

前后轴对齐 该实验方案将所有胚胎定向，使后端埋入琼脂中，前端朝上（图3）。这种方向性有利于保持一致性，从而可以在离心过程中利用动孔作为解剖标志来判断哪一端朝上（图1，5）。然而，经过练习后，通过明场显微镜观察脂滴层和卵黄层的明显形态差异，很容易辨别离心后胚胎的方向。因此，可以灵活地以任一端朝上的方式封片；这种灵活性可加快封片过程。

非定向离心 该实验方案中最耗时且技术上最具挑战性的步骤是将胚胎固定在琼脂中（步骤4）。此过程需要接触每个胚胎两次（一次是将其插入孔中，另一次是在离心后回收）。作为替代方法，可以在步骤4.1中将胚胎转移至装有TSS的微量离心管中。当这些管子在微量离心机中离心（13,000 rpm，10–30分钟）时，胚胎通常也能形成良好的分层^10–13。这种变通方法可实现同时快速处理数百个胚胎。然而，分层效果的一致性较差；尽管施加的离心力远高于上述方案（约16,000 g），仍有部分胚胎无法形成清晰的分层。更具挑战性的是，胚胎的朝向具有可变性，可观察到其分离方向相对于胚胎主轴呈不同角度。这种变异性要求实验人员在离心后判断每个胚胎在离心管中的具体排列方式。利用卵黄的自发荧光作为胚胎最致密部分的标记，通常可以实现这一判断，但需要大量实践经验以及较强的主观判断能力才能可靠完成。如果样本中胚胎数量足够，可能可以筛选出那些恰好如图1所示方式排列的胚胎。

在卵壳中对胚胎进行离心 在第4步中，可以不先去除卵壳（chorion）而直接将胚胎包埋于琼脂中²。在此方法中，第3.2步使用卤代烃油覆盖收集板上的胚胎，代替50%次氯酸钠溶液（卤代烃油可使卵壳变为半透明）。选择处于合适发育阶段的胚胎，用镊子将其转移至新的琼脂板；操作时仅夹取卵丝部分，以避免损伤胚胎本体。随后按照第4.4至4.8步的方法将胚胎包埋，使前端的卵丝从琼脂孔中露出。在胚胎经离心并按第5.4步从琼脂中挖出后，再通过50%次氯酸钠处理去除卵壳。在保留卵壳的情况下进行离心，可能有助于提高固定后（第6.2步）去卵黄膜的效率，但为离心选择正确发育阶段的胚胎（第4.2步）会更具挑战性。

应用

胚胎离心对于共定位实验特别有用，例如用于检测某种特定蛋白质是否定位于某一主要细胞器。例如，Klar蛋白存在于早期胚胎的脂滴上，但这种定位在完整胚胎中难以证明。部分原因在于Klar斑点和脂滴在胚胎外围均十分丰富¹⁰，使得偶然共定位难以排除。然而，离心可将脂滴浓缩成一个明显的层次，从而使Klar信号的共定位变得清晰可见¹⁰。

类似分析已明确证实其他蛋白质定位于脂滴^{8, 13-15}，其中包括一些出人意料的例子，如某些组蛋白²，以及某些在细胞中普遍存在但在脂滴上富集的蛋白质⁸。由于可凭视觉根据发育阶段选择胚胎（步骤4.2），甚至能够检测到蛋白质在发育调控下向脂滴的募集^{8, 15}。检测与脂滴的共定位尤为简便，因为脂滴在离心后会形成视觉上明显的“帽状”结构，因此无需额外的标记物或染色即可识别该层。事实上，由于该方法操作简便且可能获得显著的视觉结果（图1，图5 D、E），本实验室现已常规采用该技术作为初步检测候选蛋白质是否定位于脂滴的方法。原则上，类似的共定位研究也应适用于图1中所示的其他细胞器，以及可能包括尚未在离心胚胎中明确分布的细胞内寄生虫在内的其他结构。

由于离心可将细胞器浓缩成紧密的条带，因此有助于分离富含这些细胞器的组分。该方法已用于回收脂滴并移植到受体胚胎中²。也有可能对富集的组分进行生物化学分析（例如，在固定后切取胚胎的不同层次进行分析¹⁵）。

此处所述方法的应用范围不限于 果蝇 胚胎，因为离心可用于对多种不同物种的卵进行分层（包括青蛙、线虫、被囊动物、环节动物、海胆、软体动物和刺胞动物） ¹⁶在我们自己的实验室中，已将上述方案用于家蝇的胚胎 家蝇 ² 并采用无定向离心法分析了真菌蚊胚胎 Sciara coprophila ¹⁷ 和蜗牛 Ilyanassa obsoleta ¹⁷最后，该方法不仅限于胚胎：离心也可用于分层其他大型细胞，例如卵母细胞（如 黑腹果蝇 ^{2, 18} 以及马利筋虫 Oncopeltus fasciatus ¹⁷）。对于不同样本，离心条件需进行优化：例如，3000 × g 离心10分钟足以有效分层胚胎 家蝇 ²，如果离心时间过长，胚胎在固定和免疫染色过程中容易破裂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60x15 mm 培养皿	BD Biosciences	#35-1007	来自 Falcon
金属丝网	Small Parts, Inc.	CX-0150	304 型不锈钢；网目规格 #150 x150，金属丝直径：0.0026 英寸
钨针	Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria 镍镀针/针头夹持器	Fine Science Tools	26016-12
果蝇饲养笼	Genesee Scientific	59-100 或 59-101	分别用于直径为 65 mm 或 100 mm 的培养皿
卤代烃油 27	Sigma-Aldrich	H8773