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利用微阵列技术对tRNA的氨酰化（荷载）水平进行全基因组分析

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DOI：

10.3791/2007

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2010年6月18日

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago

本文内容

摘要

我们描述了一种微阵列分析方法，用于测定酿酒酵母（S. cerevisiae）中所有tRNA的相对氨酰化水平。

摘要

tRNA 氨酰化（或称充电）水平会随着环境变化在细胞内迅速改变[1]。原核和真核细胞中 tRNA 充电水平的变化可导致翻译调控，这是细胞应激反应的重要机制之一。常见的例子包括原核生物中的严谨反应E. coli以及酵母中的Gcn2应激反应通路（[2-6]）。近期的研究工作在E. coli和S. cerevisiae已表明，tRNA 荷载模式具有高度动态性，并取决于细胞所经历的应激类型 [1, 6, 7]。tRNA 荷载的高度动态性和可变性使得在基因组尺度上测定 tRNA 荷载水平的变化至关重要，以全面阐明细胞对环境变化的响应。在本综述中，我们介绍了一种同时测定所有 tRNA 相对荷载水平的方法S. cerevisiae . 尽管本文所述方案针对酵母，但该方案已成功应用于多种生物体中相对氨酰化水平的测定，包括E. coli以及人类细胞培养[7, 8]。

方案

第1部分：总带电tRNA的分离

  1. 在台式离心机中以 2000 RFC 离心 5 分钟收集细胞。相当于 1 OD600 的细胞应至少产生 1 μg 总 RNA，建议本实验使用不少于 30 μg 的 RNA。
  2. 用裂解缓冲液重悬细胞，裂解缓冲液由 0.3 M 缓冲 Na+-乙酸盐（pH 4.5）和 10 mM EDTA 组成。加入等体积的 Na+-乙酸盐饱和酚/氯仿（pH 4.5），涡旋振荡 3 次，每次 30 秒。每次涡旋后务必立即将样品置于冰上。缓冲乙酸盐可用 NaOAC 和 HOAc 配制，乙酸盐饱和酚/氯仿可通过将 1 份 5 M 缓冲乙酸盐（pH 4.5）与 9 份酚/氯仿混合制备。
    注意：总 RNA 的分离需在弱酸性条件和冰上进行，以避免荷载 tRNA 的脱酰基化。
  3. 在 4°C 下以 18,600 RFC 离心 15 分钟，收集水相，并再次进行乙酸盐饱和酚/氯仿抽提。
  4. 第二次抽提后，加入 2.7 倍体积的乙醇沉淀 RNA，并在 4°C 下以 18,600 RFC 离心 30 分钟。
  5. 将 RNA 沉淀重悬于裂解缓冲液中，再用乙醇进行第二次沉淀。
  6. 最后，将 RNA 重悬于含 10 mM 缓冲乙酸盐（pH 4.5）和 1 mM EDTA 的溶液中，用于后续处理。样品可在 -80°C 稳定保存约两周。不建议更长时间保存，因为部分荷载 tRNA 会开始发生脱酰基化。

第二部分：tRNA 标准品的制备

  1. 将浓度为 10.5 μM 的 E. coli tRNA 标准品在 45 mM Tris-Cl（pH 7.5）中于 85°C 加热 2 分钟。取出离心管，室温下静置 3 分钟。
  2. 加入 MgCl2 至终浓度为 20 mM，并在 37°C 下孵育 5 分钟。
  3. 加入氨酰-tRNA 合成酶反应混合液，使最终反应体系包含 5 μM tRNA、60 mM Tris-HCl（pH 7.5）、12.5 mM MgCl2、10 mM KCl、3 mM 二硫苏糖醇、1.5 mM ATP、1 mM 精胺、1 mM 对应氨基酸以及 4.2 单位/μl 的 E. coli 氨酰-tRNA 合成酶混合物。在 37°C 下孵育 15 分钟。
  4. 加入等体积的 0.5 M 缓冲乙酸盐（pH 4.5），并在 pH 4.5 条件下用乙酸盐饱和的苯酚/CHCl3 进行抽提。
  5. 用 2.7 倍体积的乙醇沉淀 tRNA 标准品，并在 4°C 下以 18,600 ×g 离心 30 分钟。
  6. 将标准品重悬于含 1 mM EDTA 的 50 mM 缓冲乙酸盐（pH 4.5）中，于 −80°C 保存，可稳定保存一个月。

第3部分：tRNA的Cy3/Cy5标记

  1. 对于带电tRNA样品，将总RNA在0.1浓度下孵育 μ克/μl 与 0.066 μM 每个 E. coli tRNA 标准品（即每种标准品 0.67 pmol 每个） μg 总 RNA）和 100 mM 乙酸盐缓冲液（pH 4.5），在 50 mM NaIO₄ 存在下室温孵育 30 分钟。对照组总 tRNA 样品则用 50 mM NaCl 替代 NaIO₄。请注意仅使用缓冲溶液稀释 RNA，以保持其荷载状态。
  2. 加入葡萄糖至终浓度为100 mM以终止反应，并在室温下孵育5分钟。
  3. 为了去除样品中残留的 NaIO4，使用 G25 离心柱进行缓冲液置换。为获得最佳效果，在上样前先用 200 mM 乙酸盐缓冲液（pH 4.5）平衡柱子。
  4. 通过加入缓冲乙酸盐（pH 4.5）至终浓度133 mM、NaCl至终浓度66 mM以及2.7倍体积的乙醇，使样品沉淀。氧化样品有时可能需要进行第二次沉淀。仅当样品沉淀物与同一样品的对照沉淀物在形态上存在明显差异时（例如沉淀物显著更大或更弥散），才需进行第二次沉淀。若需进行第二次乙醇沉淀，应先将沉淀物重悬于50 mM乙酸盐缓冲液（pH 4.5）和200 mM NaCl中，再加入乙醇。
  5. 对于去酰化，将tRNA样品重悬于50 mM Tris-HCl（pH 9）中，并在37℃下孵育 °C 反应 30 分钟。加入等体积的 50 mM 缓冲醋酸盐（pH 4.5）和 100 mM NaCl 中和反应。用 2.7 倍体积的乙醇沉淀。沉淀后，RNA 重悬于水中，浓度约为 1 μ克/μl. 应将对照样品和氧化处理样品均在琼脂糖凝胶上电泳，以检测RNA质量。
  6. 将荧光寡核苷酸标签连接到 tRNA 0.1 μ克/μl 脱乙酰化 RNA 在 1x 连接酶缓冲液、15% DMSO、4 μ含 Cy3 或 Cy5 的寡核苷酸，0.5 单位/μl T4 DNA连接酶和酵母外切磷酸酶（5,000单位/μl) 在 16°C 过夜（超过16小时）。外切磷酸酶仅对从酵母获得的样品是必需的，如果本方案用于其他样品，则可省略该步骤。 E. coli 或人源样本。
  7. 连接反应完成后，将样品与4倍体积的50 mM KOAc（pH 7）、200 mM KCl混合，再用等体积的苯酚/氯仿抽提。抽提后取水相，用乙醇沉淀RNA，然后溶于水，浓度约为0.1 μ克/μl.
  8. 连接效率可通过将5-10%的样品在含7 M尿素的12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用荧光凝胶扫描仪进行可视化来评估。该PAGE分析还有助于确定微阵列杂交所需的氧化样品和对照样品的用量。理想的连接结果应显示约10%或更多的含Cy3/Cy5的寡核苷酸成功连接至tRNA。对于标记效率良好的样品，0.1–0.5 μ每份样品使用 g 总 RNA 进行芯片杂交。

第4部分：微阵列的杂交与分析

  1. 杂交前，将微阵列芯片在蒸馏水中煮沸1-2分钟，以去除未结合的寡核苷酸。
  2. 将Cy3/Cy5标记的样品与140 μl杂交缓冲液、鲑鱼精子DNA（终浓度为140 μg/ml）以及poly(A)（终浓度为70 μg/ml）混合。
  3. 在自动芯片杂交仪上运行杂交程序（表1）。对于tRNA实验，强烈建议使用自动杂交设备，因为手工杂交会导致较高的背景信号。
  4. 程序结束后，将芯片置于50 ml锥形管中，用Wash 3溶液轻轻振荡洗涤至少两次，每次3-5分钟。
  5. 可通过低速离心（转速低于200 RFC）5-10分钟干燥芯片。必须避免光照，因为暴露于光下会导致荧光染料漂白。
  6. 芯片干燥后应立即扫描以获得最佳结果；如有必要，可在室温下干燥避光环境中保存数天。芯片可重复扫描2-3次，图像质量无明显下降。

第5部分：代表性结果

若分离操作得当，总RNA样品应产生非常清晰的光谱，其OD260:OD280比值接近2。样品中应无蛋白质或苯酚污染的可检测信号。在1%琼脂糖凝胶电泳中，应观察到明显的tRNA条带，其他核酸条带则因生物种类不同而有所差异。氧化后应观察到清晰的tRNA条带。若某样品信号明显弱于其他样品，或出现拖尾现象，则不应将其用于微阵列实验。微阵列的背景信号应非常低，通常比最弱的tRNA探针信号低一个数量级。高背景信号通常源于洗涤步骤中的问题，一般可通过配制新鲜的洗涤液，并彻底清洗所有设备和管路以去除残留及析出的SDS来解决。

步骤细节
O形圈预处理75°C，2 分钟
加入样本60°C
样本变性90°C，5 分钟
杂交60°C，16 小时
洗涤 150°C，流动 10 秒，暂停 20 秒
洗涤 242°C，流动 10 秒，暂停 20 秒
洗涤 342°C，流动 10 秒，暂停 20 秒

表1：杂交实验步骤

讨论

我们介绍一种可在基因组尺度上同时测定所有tRNA相对荷载水平的方法。本文所述方案已针对S. cerevisiae进行优化，并已成功用于测定E. coli和人源细胞培养物中的tRNA荷载谱型。只要能够获得完整的荷载tRNA，该方法可经修改后适用于任何具有已知基因组序列的生物体（以便注释全部tRNA基因）。

致谢

Pan实验室的酵母研究工作由日本味之素公司（Ajinomoto, Inc. Japan）以及美国国立卫生研究院培训基金T32GM007183-33资助。我们感谢印第安纳大学医学院的Ronald Wek博士长期以来在酵母项目上的合作，同时也感谢Kimberly Dittmar博士开发了tRNA荷载微阵列方法。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Microspin G-25 柱GE Healthcare25-5325-01
E. coli tRNAPheSigma-AldrichR3143
E. coli tRNATyrSigma-AldrichR0258
E. coli tRNALysSigma-AldrichR6018
E. coli 氨酰-tRNA 合成酶Sigma-AldrichA3646
T4 DNA 连接酶USB Corp., Affymetrix70042X
PerfectHyb PlusSigma-AldrichH-7033
Hyb4 杂交站Digilab
GenePix 4000B 扫描仪Axon instruments
GenePix 6.0Axon instruments

参考文献

  1. Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  2. Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
  3. Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
  4. Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
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  7. Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  8. Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).

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