利用光镊测量细菌细胞的弯曲刚度

摘要

我们介绍一种利用光镊弯曲附着在盖玻片表面的丝状细菌细胞的实验方案，以测量细胞的弯曲刚度。

摘要

我们开发了一种用于测量丝状杆状细菌弯曲刚性的实验方案。实验中使用光镊施加力，光镊是一种由光构成的微观三维弹簧，当高强度激光束通过显微镜物镜聚焦到极小光斑时形成。为了使细胞发生弯曲，我们首先将活细菌结合到经化学处理的盖玻片表面。随着细胞生长，细胞中部仍固定于盖玻片，而两端则自由延伸。通过使用药物头孢氨苄诱导细胞产生丝状生长，我们可以识别出一端固定于表面、另一端游离且可受弯曲力作用的细胞。随后，将经多聚赖氨酸包被的微球结合至生长中细胞的游离末端，利用光镊施加弯曲力。同时记录微球所受的力及其位移，细胞的弯曲刚度即为该力-位移关系曲线的斜率。 关键词：弯曲刚性，丝状细菌，光镊，杆状细菌，头孢氨苄，多聚赖氨酸微球，弯曲刚度

方案

1. 将大肠杆菌细胞在LB培养基（Luria-Beltrani broth）中培养至对数生长期（OD = 0.2–0.4）。
2. 在LB培养基中加入50 μg/mL头孢氨苄，继续培养15分钟以诱导丝状生长，随后通过离心将菌液浓缩5倍。
3. 通过将1%聚乙烯亚胺（polyethylenimine）水溶液注入流动池中，孵育5分钟后用水冲洗，制备PEI包被的盖玻片。
4. 将浓缩后的菌液注入流动池，3分钟后用含头孢氨苄（50 μg/mL）的LB混合液冲洗，以去除未贴壁的细胞。
5. 将流动池置于37°C孵育30分钟至1小时，使贴壁细胞充分生长，随后将其放置于光镊装置上进行实验。
6. 将直径为0.5 μm的聚苯乙烯微球（Bangs Labs）与0.1%多聚赖氨酸（polylysine）水溶液孵育30分钟，制备多聚赖氨酸包被的微球；随后洗涤3次，并重悬于水中。
7. 将微球悬液用含头孢氨苄（50 μg/mL）的LB培养基稀释两倍后，加入流动池中。
8. 使用光镊捕获悬浮微球，并将其接触细胞的游离末端。（我们使用Mad City Labs压电载物台来控制样品的运动。）当找到合适的微球-细胞组合后，用含头孢氨苄（50 μg/mL）的LB溶液冲洗流动池，以去除未结合的微球。
9. 运行自行编写的LabView程序，对细胞施加弯曲力并记录力-位移数据。 程序细节
   1. 通过对附着微球在检测激光束内进行光栅扫描，并记录三维PSD电压信号，校准探测器响应。
   2. 在显微镜图像中识别细胞的长轴方向。
   3. 沿垂直于细胞长轴的方向，以步进方式移动细胞。
   4. 记录移动的距离以及相对于光镊的位移量。
   5. 利用先前测定的光阱刚度将位移转换为施加的力，并将尖端位移和力数据保存至文件。

成功的秘诀：在第8步中，需要找到一个末端粘附清晰的细胞。有些细胞仅在一端粘附，另一端的弯曲力会导致整个细胞发生旋转，而非弯曲。通过使用操纵杆控制载物台移动，快速手动弯曲每个细胞，从而找到合适的细胞对。

代表性结果：

图1. 该图显示了一个单细胞的力-位移数据。该直线的斜率即为细胞的弯曲刚度。

讨论

本文介绍的实验方案旨在定量测量细菌细胞的弯曲特性。该实验装置可适用于任何能够诱导生成丝状结构的杆状细胞。我们已成功利用此装置研究了细胞骨架纤维对大肠杆菌（E. coli）细胞弯曲刚度的影响。该技术同样可用于评估压力、细胞壁刚度以及其他细胞内组分在决定细胞整体弯曲刚度中的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
头孢氨苄	Sigma-Aldrich	C4895-5G
聚乙烯亚胺	Sigma-Aldrich	181978-5G
聚赖氨酸	Sigma-Aldrich	P8920
直径0.5-μm的聚苯乙烯微球	Bangs Laboratories	PS03N
Nano-LP 系列纳米定位系统	Mad City Labs	NanoLP series	http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html