Method Article

测量细菌细胞的抗弯刚度，使用光学陷阱

DOI:

10.3791/2012

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April 26th, 2010

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1Department of Molecular Biology, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 2Department of Physics, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University

In This Article

Summary

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我们提出了一个封面防滑表面附有一个光学陷阱来衡量细胞的抗弯刚度弯曲的丝状细菌细胞的协议。

Abstract

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我们制定了一个协议来衡量的丝状杆状细菌的抗弯刚度。应用光学陷阱，一个微小的三维光的春天，高强度的激光束聚焦显微镜的物镜，一个非常小的点时会形成部队。弯曲的单元格，我们首先将活的细菌，化学处理过的盖玻片的。由于这些细胞的生长，细胞中仍然绑定到盖玻片，但不断增长的结束是这个约束的自由。通过诱导药物头孢氨苄丝状增长，我们能够识别细胞在被粘表面的细胞的一端，而另一端仍然是独立的和受弯曲力。通过结合一个多聚赖氨酸涂层珠越来越细胞的一角，一个弯曲的力量，然后应用与光学陷阱。珠的力量和位移记录和细胞的抗弯刚度是这种关系的斜率。

Protocol

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  1. 卢里亚Beltrani肉汤（LB）培养基中的大肠杆菌细胞生长指数生长期（OD = 0.2-0.4）。
  2. 增长在50微克/毫升头孢氨苄15分钟诱发丝状增长为辅的LB培养，然后通过离心5次集中的文化。
  3. 流流室加水稀释成1％的聚乙烯涂层裴盖玻片，孵育5分钟后用清水洗净。
  4. 流入集中的细胞培养室，3分钟后冲洗，以去除独立的细胞，LB和头孢氨苄（50μg/mL）的混合物。
  5. 室在37℃，30分钟1小时让贴壁细胞上的光学诱捕仪器安置前的生长。
  6. 孵化在直径0.5微米的聚苯乙烯珠（刘海实验室）30分钟的水稀释0.1％多聚赖氨酸多聚赖氨酸包被的磁珠。然后洗珠的3倍，并重新悬浮在水中。
  7. 珠的解决方案由两个因素与头孢氨苄（50μg/mL）LB稀释，并添加到流室。
  8. 光陷阱一个漂珠，触摸到一个单元格的免费提示。 （我们使用一个疯狂的城市实验室压电阶段控制样品的议案。）当找到一个合适的珠/单元组合，洗磅（50μg/mL）室与头孢氨苄删除独立的珠子。
  9. 运行自定义编写的LabVIEW程序申请弯曲力，细胞和记录力 - 位移数据。节目详情
    1. 校准光栅扫描范围内检测激光束和录制3D PSD电压信号的附加珠探测器响应。
    2. 确定细胞在显微镜图像的长轴。
    3. 将细胞在细胞长轴垂直方向的步骤。
    4. 记录移动的距离从光陷阱和位移。
    5. 转换位移施加的力，使用以前测量的陷阱刚度和节省尖位移和力文件。

成功秘诀:在第8步），需要找到一个定义良好的粘结束​​的细胞。一些细胞只是停留在一个提示，并在其他尖端弯曲力，导致整个细胞旋转，而不是弯曲。找到一个合适的一对是由每个细胞迅速弯曲手使用操纵杆控制阶段的议案。

代表性的成果:

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图1此图显示了一个单细胞的力-位移数据。这条生产线的斜率是细胞的抗弯刚度。

Discussion

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这里介绍的协议的目的是定量测量细菌细胞的弯曲性能。实验装置可应用于任何杆状细胞可以取得增长filamentously。我们已经成功地使用此设置探头E.抗弯刚度骨架细丝的影响大肠杆菌细胞。同样的技术可用于评估的压力，细胞壁的刚度和其他细胞内的组成部分，在决定细胞的整体抗弯刚度的作用。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们承认，从酿名斋孙约束力的细胞表面有用的建议。我们感谢斯内德Wingreen Zemer Gitai有价值的讨论。这项研究是由国家卫生研究院授予P50GM07150，国家科学基金事业奖的PHY - 0844466和Alfred P. Sloan基金会的支持。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
头孢氨苄Sigma-AldrichC4895-5G
聚乙烯亚胺Sigma-Aldrich181978-5G
聚赖氨酸Sigma-AldrichP8920
0.5-μm 直径聚苯乙烯珠Bangs LaboratoriesPS03N
Nano-LP 系列 纳米定位系统Mad City LabsNanoLP 系列http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  2. Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).

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