本文由该方法的发明者介绍了用于气相色谱/质谱分析中间代谢物的尿素酶样品制备法。该方法通过一步法定量检测碳水化合物、有机酸和氨基酸，实现了基于串联质谱技术对新生儿筛查中先天性代谢缺陷的后续跟踪。
本文内容
摘要
摘要
目前，美国出生的每名婴儿都会接受多达42种被称为“先天性代谢错误”的罕见遗传病筛查。该筛查方法基于串联质谱技术，通过定量酰基肉碱来检测有机酸血症，同时测定氨基酸水平。所有州还对半乳糖血症等碳水化合物代谢疾病进行酶学检测。由于初筛结果可能缺乏特异性，阳性结果需通过更确证的方法进行后续检测。本报告描述了用于先天性代谢错误筛查的“尿素酶法”样本前处理方法。该方法使用结晶态尿素酶酶解体液中的尿素，从而使大多数其他水溶性代谢物可在单一操作流程中完成脱水和衍生化，以适用于气相色谱分析。在氮气流中蒸发脱水的过程通过添加乙腈和二氯甲烷得以促进。随后，在独特的催化剂三乙基氟乙酸铵存在下进行三甲基硅烷化反应。自动化进样和色谱分析完成后，通过宏程序驱动，利用经三甲基硅烷（TMS）衍生化生物化合物的质谱数据库，对192种代谢物进行定制化定量分析，并对所有主要组分进行半定量分析。该分析可在广泛使用的Chemstation平台上完成，所需宏程序和数据库可由作者提供。在本实验室，已采用该方法分析超过16,000份患者样本，诊断率约为17%——即17%的样本结果提示临床医生需采取相应诊疗措施。其中包含180余例确诊的先天性代谢错误，约38%的病例是既往方法无法诊断的。
方案
尿液样本处理步骤
- 将尿液样本在 37°C 水浴中解冻。若原始容器受损，需将样本转移至新容器中。
- 取最大 13 ml 的样本 aliquot，置于已标记的锥形离心管中，并在 -20°C 下保存。
- 使用折射仪测量样本的折射率，取数滴尿液置于仪器中，记录其光学密度。
- 通过 0.2 μm 滤膜对样本进行过滤。
- 根据样本的光学密度，量取下表所示体积：
1.000–1.009 1.00 ml 1.010–1.019 0.50 ml 1.020–1.050 0.25 ml + 0.25 ml H2O - 将上述指定体积的样本转移至一个含有以下内标物的 Reactivial 管中：500 纳摩尔（nmoles）3 肌酸；10 nmoles d3 甲基丙二酸；每种以下物质各 100 nmoles：13C3 乳酸、13C3 丙酮酸、13C2 15N 甘氨酸、d3 丝氨酸、d5 苯丙氨酸、d11 己酰甘氨酸、15N2 乳清酸、d4 癸二酸、13C6 葡萄糖、d6 肌醇和 d5 色氨酸。
- 向样本中加入 20 微升（μl）浓度为 7.5 单位/μl 的脲酶溶液（Calzyme Laboratories 货号 116A0100），然后通过惰性隔垫用 CO2 冲洗并密封。
- 将样本在 37°C 下孵育 30 分钟，每隔 15 分钟补充一次二氧化碳气体以维持压力。
- 再加入 20 μl 脲酶溶液，用二氧化碳冲洗反应管，并在 37°C 下继续孵育 15 分钟。
- 加入 500 μl 的丙酮:甲醇（30:70）混合液，将橡胶隔垫更换为聚四氟乙烯（Teflon）涂层隔垫，并在 -20°C 下冷却 15 分钟。
- 以 1500 rpm 离心 10 分钟去除固体成分，上清液倾入洁净的 2.0 cc Reactivial 管（Supelco/Sigma）中。
- 按以下方式加入三乙胺三氟乙酸盐（TEA/TFA）（Sigma）：
- 1.00 ml 样本加入 20 μl
- 0.5 ml 或更少样本加入 40 μl
- 用乙腈定容，并在 70°C 氮气流下吹干至恒定体积（TEA/TFA 将保留），约需 15 分钟。
- 重复第 13 步，最多 4 次，直至出现沉淀（每次约 10 分钟）。
- 冷却约 2 分钟。小心加入二氯甲烷（避免沸腾溢出），吹干约 4 分钟。
- 重复第 15 步。
- 按以下比例加入 MSTFA（N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺）（Thermo Scientific）：
- 1.00 ml 样本加入 150 μl
- 0.50 ml 或更少样本加入 200 μl
- 在氮气氛围下密封，于 70°C 孵育 1 小时。
- 在氮气氛围下转移至微量进样瓶，用于气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）分析。
- 将微量进样瓶置于 Agilent 5975 GC/MS 自动进样器中进行分析。仪器温度设置如下：进样口 200°C，接口 250°C，柱温箱初始 80°C 保持 1 分钟；以 4°C/分钟升温至 130°C，再以 6°C/分钟升温至 200°C，最后以 12°C/分钟升温至 285°C，保持 10 分钟。色谱柱：DB-5，25 m，内径 320 微米，膜厚 0.5 微米。质谱条件：离子源 230°C，四极杆 150°C，扫描范围 50–650 amu，扫描速率 2.46 次/秒，溶剂延迟 3.5 分钟。
代表性结果
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讨论
尿素酶法（1）在医学文献中已被引用62次，并有多种改良方法。松本（Matsumoto）研究组（2,3）简化了该方法以适用于高通量新生儿筛查，并报告了来自16000例患者的结果。桑原（Kuhara）等人（4-7）报道了该方法在多种先天性代谢缺陷诊断与随访中的应用。Rhead（8）也证实了该方法在先天性代谢缺陷的临床诊断与随访中的实用性。该方法已被应用于熊、基因敲除小鼠、大象的尿液，以及整只果蝇及其幼虫匀浆样品的分析（9）。此外，还对位点定向诱变前后隐球菌（Cryptococcus）的培养基进行了分析，但未进行尿素酶处理步骤（10）。该方法已被用于医学生、唐氏综合征患者以及老年痴呆退伍军人在口服色氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸负荷后的营养状况评估（11）。通过定量这三种氨基酸的降解产物，可评估全部八种B族维生素，因为这些氨基酸在降解过程中均分别依赖全部8种维生素。已有研究报道了药物的毒性作用及其通过补充维生素得以缓解的情况（12）。正常妊娠与唐氏综合征妊娠的羊水样本也已被分析并报道（13-15）。
披露
代谢筛查实验室是圣路易斯大学（一家非营利性机构）拥有的经CLIA认证的临床实验室。Shoemaker博士不直接从实验室收入中获利，但可能间接受益于实验室的运营成果。所有方法、技术、结果、正常参考范围、宏指令、软件、数据库或结论均不视为专有，可供感兴趣的各方自由使用。
致谢
感谢 Anthony Thomas 提供的出色技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MSD 5975 | Agilent Technologies | 气相色谱/质谱/计算机 | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | 气相色谱/质谱/计算机 | |
| 脲酶 | Calzyme | 116A0100 | 亦见 Sigma C3 |
| 稳定同位素标准品 | CDN Isotopes | ||
| 溶剂 | Fisher Scientific | ||
| 分析物 | Sigma-Aldrich | ||
| 气相色谱柱 | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| 小瓶 | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
参考文献
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