一种用于检测胚胎发生过程中功能冗余的反向遗传学方法

摘要

如果存在其他基因的补偿作用，基因功能在功能缺失实验中可能会被掩盖。斑马鱼模型能够在活体胚胎中相对高效地揭示此类功能冗余。

摘要

在胚胎发生过程中，基因功能通常通过功能缺失实验来确定，例如在小鼠中进行靶向诱变（基因敲除）。在斑马鱼模型中，已开发出有效的反向遗传学技术，即通过显微注射针对特定基因的反义吗啉环寡核苷酸（morpholino）。吗啉环寡核苷酸通过特异性碱基配对靶向mRNA，并在胚胎发育的数天内通过抑制翻译或剪接而暂时阻断基因功能（基因敲降）。然而，在小鼠或斑马鱼等脊椎动物中，由于存在可补偿功能缺失的其他基因，某些基因功能可能在这些实验中被掩盖。这种情况在含有共表达于相同发育组织中的同源基因的基因家族中尤为常见。在斑马鱼中，可通过同时注射靶向两个基因的吗啉环寡核苷酸，以相对高通量的方式检测功能补偿现象。同样，通过使用吗啉环寡核苷酸将两个基因共同敲降至亚阈值水平，可验证任意两个基因之间的遗传相互作用。例如，可对吗啉环寡核苷酸进行剂量滴定，使得单独敲降任一基因均不产生表型。若在此条件下，共注射两种吗啉环寡核苷酸引发表型，则表明存在遗传相互作用。本文中，我们以两个相关的GATA转录因子为例，演示如何揭示功能冗余现象。GATA因子对心脏前体细胞的特化至关重要，但只有当Gata5与Gata6同时缺失时，这一功能才得以显现。我们展示了如何开展显微注射实验、验证吗啉环寡核苷酸的有效性，并评估心脏发育中的补偿性表型。 关键词：基因功能，胚胎发生，吗啉环寡核苷酸，基因敲降，功能冗余，遗传相互作用，GATA转录因子，心脏发育，斑马鱼，显微注射

方案

我们的目标是检验两种转录因子在心肌细胞前体特化过程中的功能冗余性。这两种因子由两个相关基因gata5和gata6编码，我们利用斑马鱼模型来研究它们的相对功能¹。我们的策略是使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）来阻断基因功能²。我们将把针对其中一个或另一个基因的吗啉代注射到受精卵中，并将所得胚胎表型与同时注射两种吗啉代的受精卵发育而来的胚胎进行比较。为了简化表型评估，我们使用来源于携带心肌细胞特异性表达GFP转基因鱼的受精卵。

步骤 1. 准备显微注射。

A) 建立鱼类繁殖配对

注射前一晚，将单条雄性与单条雌性成年鱼（3至18月龄）按配对方式放入繁殖缸中，并用隔板分隔，直至次日早晨。我们通常设置10至20对鱼，无论卵子是否会被使用，均每周交配一次，以维持其繁殖能力。本实验采用一种报告基因品系，该品系转基因表达cmlc2:egfp，因其可提供简便的信号输出，用于识别正在分化的心肌细胞。次日早晨开灯后，更换水体，并移除隔板，使鱼对交配并产卵。可对产卵过程进行监测，产卵可能立即开始，也可能在1小时或更长时间后开始，具体取决于鱼的状态。通常，在持续交配约20分钟后，使用移液管或滤网收集卵子，并倒入含有系统水的100 mm培养皿中。监测产卵时间至关重要，以确保胚胎在1至4细胞期....

讨论

在本实验中，我们联合使用了两种吗啉代寡核苷酸（morpholino），每种单独注射时均可产生不同的表型，而当二者共同注射时，却出现了完全不同的表型。当然，我们首先需要有合理的依据来开展这一实验。我们推测，这两个基因可能在早期功能（在此为心脏特化过程）中具有相互补偿作用。这是因为这两个基因具有高度同源性（能够结合相同的DNA序列），并且在胚胎发育过程中表达模式存在重叠⁵。此外，果蝇（Drosophila）中的遗传学实验表明，GATA转录因子应参与心脏特化过程⁶。

然而，该策略还可用于其他情况，例如测试功能冗余性或更广泛的遗传相互作用。首先，对一个或两个基因进行敲低可能不会产生任何明显表型。在这种情况下，每个基因没有明确的阈值水平，所使用的吗啉代寡核苷酸（morpholino）用量需通过实验经验确定，并受限于胚胎对其耐受程度。同样，测试补偿效应的依据通常在于这些基因具有高度同源性，并且已被证实存在共表达模式。其次，可通过使用低于阈值剂量的吗啉代寡核苷酸来检测任意基因对之间的遗传相互作用。在此策略中，每种吗啉代寡核苷酸的使用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鱼类繁育水箱和隔离板	Aquatic Habitats
捞鱼网	Aquatic Habitats
系统用水			每升去离子水中加入60mg Instant Ocean”
100 mm 培养皿	BD Biosciences	351029
微量移液针拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97 Flaming/Brown
3.5" 玻璃毛细管	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
剃须刀片	Personna Medical Care	94-120-71
微型研磨器	Narishige International	EG-4
带网格的显微镜目镜	Premiere	MF-02
千分尺	WARD’s Natural Science	94 W 9910
超纯琼脂糖	Invitrogen	15510-027
刮勺	Fisher Scientific	14-357Q
电子天平	Mettler Toledo	AB54-S/FACT
一次性称量皿	Fisher Scientific	2-202-B
普通微波炉	GE Healthcare
锥形瓶	Corning	4980
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-552
量筒	Fisher Scientific	08-572-6D
自动移液器控制器	BrandTech	2026333
70% 乙醇清洗液	Tarr	801VWR
氮气罐	Tech Air
显微注射仪	Harvard Apparatus	PLI-100
显微操作器	Micro Instruments	LTD
体视显微镜	Nikon Instruments	SMZ1500
Parafilm 封口膜	American National Can	PM-992
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904
吸水纸（Kimwipes）	Kimberly-Clark Corporation	34155
gata5 剪接位点吗啉代寡核苷酸	Genetools, LLC		5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’
gata5 ATG 阻断型吗啉代寡核苷酸	Genetools, LLC		5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’
gata6 长亚型 ATG 阻断型吗啉代寡核苷酸	Genetools, LLC		5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’
一次性巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20B
三卡因甲磺酸盐（Tricaine Methanesulfonate）	Argent Labs	MS-222
甲基纤维素	ICN Biomedicals	155495
加热金属块	Fisher Scientific	11-718-4
尖头镊子	Dumont		55号
凹面载玻片	VWR international	48339-009