斑马鱼胚胎眼部组织的显微解剖

摘要

本文介绍了一种显微解剖受精后一至三天斑马鱼胚胎视网膜的方法，可保留或不保留附着的视网膜色素上皮。

摘要

斑马鱼因其快速的发育过程，成为研究眼睛发育的常用动物模型ex utero发育良好且繁殖力强。受精后3天（dpf），幼鱼即可表现出首次视觉反应。目前已鉴定出许多控制眼睛正常发育的基因，但我们对背后遗传架构的了解仍远未完整。全基因组基因表达谱分析是揭示眼睛发育遗传调控网络的有效工具。然而，斑马鱼胚胎眼睛体积较小，难以获取完整且纯净的眼组织用于表达分析。例如，第2至第3天期间眼睛的前后长度仅为约200–300 μm，晶状体直径则小于100 μm。此外，位于视网膜下方的视网膜色素上皮（RPE）仅为单层上皮。尽管可以从整个胚胎中获得基因表达谱，但这些数据无法准确反映特定组织的表达情况。因此，要成功进行眼睛发育的基因表达谱分析，必须获得纯净的组织样本。为解决这一问题，我们建立了一种显微解剖方法，可从1–3 dpf的斑马鱼中分离出完整的视网膜以及附着RPE的视网膜，覆盖了眼球形态发生的主要阶段。所有操作均可在标准体视显微镜下，使用精细镊子和常规实验器材完成。在分离视网膜时，通过刷动操作并利用RPE残留物对培养皿表面的优先黏附性，将单层RPE去除并剥离。而在分离附着RPE的视网膜时，则先消除RPE对解剖皿表面的黏附力，从而使RPE能够完整保留在视网膜上。通过谨慎地提起该组织，可有效分离脉络膜前体和巩膜。在两种情况下，均可使用化学蚀刻的钨针去除晶状体。总之，我们的方法能够获取完整的眼组织，并已成功应用于研究斑马鱼视网膜的组织特异性表达谱。^{1, 2}和视网膜色素上皮³.

方案

第1部分：显微解剖前的准备工作

1. 溶液
   1. E3 培养基⁴（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂ 和 0.33 mM MgSO₄）。
   2. Ringer 溶液^{1, 5}（116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、5 mM HEPES，pH 7.2），经滤膜除菌。
   3. 5N NaOH。
2. 钨针的化学蚀刻
   1. 用黏土将盛有 5N NaOH 的小烧杯固定在培养皿中。
   2. 在烧杯侧壁固定一个回形针，使其与 NaOH 溶液接触。
   3. 将直流电源的负极连接至回形针，正极连接至一段短钨丝（约 2 cm）的一端。
   4. 用一小团黏土包裹钨丝的另一端，并将该端浸入 NaOH 溶液中。
   5. 将电压升至约 3 V，并上下移动钨丝，直至达到理想的蚀刻速率。通常在 10 分钟内可制得高质量的针尖。
   6. 暴露于溶液中的钨丝会逐渐变细。当黏土球脱落时，仍连接正极的一端将形成尖锐的针状结构。
   7. 用 Ringer 溶液或 E3 培养基冲洗针尖，以去除盐类沉积物。
   8. 用胶带或针头夹具将针固定在木质涂布棒上，以便操作。
3. 培养皿
   1. Falcon 60 × 15 mm 聚苯乙烯培养皿可直接用于视网膜显微解剖。
   2. 若需解剖附有视网膜色素上皮（RPE）的视网膜，可在解剖前 30 分钟，于培养皿中的 Ringer 溶液内彻底碾碎两个胚胎，以消除表面黏附性。解剖前立即用新鲜 Ringer 溶液充分清洗培养皿。
4. 胚胎收集与分期
   1. 成年斑马鱼的饲养方法如文献所述^{4, 5}。
   2. 在繁殖前一天晚上，将亲鱼成对放入静水繁殖缸中，并用隔板分隔。
   3. 次日早晨开启室内光源后移除隔板，每隔半小时让亲鱼交配一次，每次交配持续 10 分钟。每次交配后重新将鱼分隔开。
   4. 将每次交配获得的胚胎分别置于 E3 培养基中，在 28°C 条件下培养。
   5. 根据已建立的标准^{1, 6}，在受精后 10 至 12 小时（hpf）对胚胎进行分期，并在解剖前特定时间点再次确认发育阶段。

第二部分：解剖——脑组织取出与眼球暴露¹

• 本节所述操作步骤适用于视网膜解剖（第3A部分）和带视网膜色素上皮（RPE）的视网膜解剖（第3B部分）。
• 所有精细解剖操作均使用Dumont镊子的尖端完成，并辅以另一把Dumont镊子固定组织位置；必要时可使用化学蚀刻钨针进行更精细的操作。
• 所有精细解剖均在配备1X物镜或等效物镜的Olympus SZX16显微镜下，以约5–8倍放大倍数进行。
• 将胚胎置于E3培养基中，并放置于显微镜旁的台式培养箱内，于28°C条件下孵育，以便在解剖过程中方便获取胚胎。
• 显微镜载物台通过加热板维持在28°C，以尽量减少温度波动对基因表达的影响。

1. 将处于特定发育阶段的胚胎转移至 Falcon 60 × 15 mm 培养皿中的任氏液中，培养皿按第1部分#3所述方法预先准备。
2. 迅速将头部连同部分前躯干从身体上切下。
3. 用辅助镊子将该组织的后端固定在培养皿上。
4. 从额部前端开始，沿背侧切开头部。
5. 移除脑组织，使眼睛的内侧面暴露并朝上，以便后续操作。

第3A部分：视网膜解剖¹

1. 按照第2部分所述方法准备胚胎。
2. 用镊子尖端轻轻刷拭朝上眼球内侧暴露的视网膜色素上皮（RPE），直至看到视网膜出现一个小开口。
3. 继续刷拭并剥离，直到视网膜内侧几乎完全暴露。避免刮伤或刺破已暴露的视网膜。
4. 对于现在朝下贴附在培养板上的视网膜外侧RPE，以约45°角从培养板表面方向进行刷拭处理。
5. 对于较牢固附着于锯齿缘的RPE，可通过将已分离的RPE部分固定在培养板上以利于解剖操作，然后轻柔抬起视网膜。
6. 将视网膜在培养皿底部滚动，以清除残留的RPE。
   1. 我们注意到，当胚胎被压碎后，这种特定的Falcon聚苯乙烯培养板对RPE具有约20分钟的优先黏附性。该特性可用于清除RPE残余物。然而，视网膜细胞也会在一定程度上黏附于培养板表面，可在高倍镜下仔细观察确认。操作时需在彻底清除RPE与保持视网膜完整性之间取得平衡。
   2. 在滚动过程中，晶状体常会黏附于培养板并从视网膜上脱离。偶尔需要使用刻蚀钨针在晶状体表面做旋转动作以将其分离。
7. 这些操作可成功去除视网膜上的RPE，同时不破坏组织完整性。这可通过良好的整体形态学（图1B和B'）和组织学结果（图1B"）加以证实。特别是光感受器层与RPE之间的细胞外基质保存极为完好（图1B"，箭头；与完整胚胎的组织学结果相比，见图1A"）。

第3B部分：RPE附着的视网膜解剖³

1. 按照第2部分所述方法准备胚胎。
2. 由助手用镊子将头部固定在培养皿中。从眼球后外侧轻轻提起眼球，并向内前侧滚动。
   1. 视网膜色素上皮（RPE）层外侧的拟脉络膜和巩膜组织与皮肤连接相对较紧，通过小心地将眼球向前侧滚动，可将其大部分剥离。
3. 在暴露眼球外侧且眼球仍与皮肤相连时，使用钨针去除晶状体。
4. 这些操作可成功保留完整的RPE层及其与视网膜的连接。拟脉络膜和巩膜组织可被基本去除（图1C、C' 和 C"）。

第4部分：RNA实验用组织样本采集

1. 解剖所得样品可收集于RNase-free微量离心管中的TRIzol内，用于后续RNA表征分析，方法如前所述¹。

代表性结果

图1. (A) 52小时（hpf）斑马鱼幼体头部的侧面图和(A')背侧图，解剖前状态。(A") 对应于(A)和(A')中幼体头部的组织学切片。(B) 54小时（hpf）解剖后视网膜的侧面图和(B')背侧图。从侧面和背侧观察，视网膜表面均保持完整。(B") 对应于(B)和(B')中解剖后视网膜的组织学切片。视网膜结构及视网膜层状结构均保持完整。特别地，光感受器层与视网膜色素上皮（RPE）之间的细胞外基质在解剖后的视网膜中（A"，箭头；B"，箭头）也得到了良好保存。(C) 52小时（hpf）附着RPE的解剖后视网膜的侧面图和(C')内侧图。RPE层完整且连续，组织学切片（C"）也证实了这一点。C'中的白色区域为视神经（箭头）。组织学分析中，组织样本经收集后用4%多聚甲醛固定，塑料包埋及切片操作按文献³所述方法进行。比例尺 = 50 μm。

讨论

斑马鱼眼部组织的显微解剖可有效获取完整视网膜以及附有视网膜色素上皮（RPE）的视网膜。这极大地有助于针对特定眼部组织（即视网膜或RPE）的表达研究。事实上，我们已成功利用这些方法获得了全视网膜¹和RPE³的RNA表达谱。这些表达谱的实用性得到了进一步证实：我们近期鉴定出在视网膜分化突变体中发生异常的信号通路和基因家族²。视网膜解剖过程中最关键的步骤是镊子尖端的刷拭操作以及用于去除RPE残留物的组织卷曲动作。我们发现，在解剖过程中将肘部置于可调节的扶手上，可显著稳定手部不必要的移动。此外，部分RPE残留物可能仍存在于锯齿缘区域，这是因为该区域在解剖时无法与培养板的黏附表面接触。尽管如此，在刷拭和剥离操作过程中，大多数RPE细胞已被破坏，这些残留的RPE细胞不太可能保持完整。同时，应在视网膜完整性与RPE清除的彻底性之间取得平衡。在解剖附有RPE的视网膜时，大多数拟似薄而透明膜状的脉络膜和巩膜组织可随皮肤一同剥离。也可通过刷拭组织表面来去除这些残留物，但同样需要在RPE完整性与污染组织清除的彻底性之间取得平衡。我们已成功从1至3天后受精（dpf，即24至72小时后受精）的斑马...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无线研磨杵电机	VWR 国际公司	47747-370
直流电源	Lascar	PSU130	任何直流电源均可使用。不同设备的具体电压需进一步优化。
一次性研杵 && 微量离心管，1.5 mL（无DNase、无RNase、无内毒素）	VWR 国际公司	47747-366	这些用于在TRIzol中收集组织以进行表达分析。
Dumont #5 镊子，尖端尺寸：0.05 × 0.01 mm，不锈钢	World Precision Instruments, Inc.	500341	细尖尺寸是可取的，但并非一成不变，因为可能需要不时对尖端进行修整。
Dumont #5SF 镊子，尖端尺寸：0.025 × 0.005 mm，不锈钢	Fine Science Tools	11252-00	细尖端尺寸是可取的，但并非一成不变，因为可能需要不时对尖端进行修整。
Falcon 聚苯乙烯培养皿，60 × 15 mm	BD 生物科学	351007	这些培养皿用作解剖板。
奥林巴斯 SZX16 体视显微镜	奥林巴斯株式会社	SZX16	任何体视显微镜均可使用。在之前的研究中，我们使用了 Leica 体视显微镜1-3 没有出现任何问题。即使我们安装了2X物镜，也仅使用1X物镜进行解剖操作。
磨刀石	Fine Science Tools	29008-01	如有需要，可用此物修锐镊子的尖端
Thermo板	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	这用于在解剖过程中维持组织的温度，并最大限度减少温度波动对基因表达的影响。我们还将整个显微镜置于温度控制在28℃的环境控制室内°C 在先前研究的解剖过程中1-3 成功率较高。
Trizol，100 mL	Invitrogen	15596-026
直径0.015英寸的钨丝	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
木制涂抹棒	普利丹	807	用于固定化学蚀刻的钨针。