斑马鱼胚胎眼部组织的显微解剖

摘要

本文介绍了一种显微解剖受精后一至三天斑马鱼胚胎视网膜的方法，可保留或不保留附着的视网膜色素上皮。

摘要

斑马鱼因其快速的发育过程，成为研究眼睛发育的常用动物模型ex utero发育良好且繁殖力强。受精后3天（dpf），幼鱼即可表现出首次视觉反应。目前已鉴定出许多控制眼睛正常发育的基因，但我们对背后遗传架构的了解仍远未完整。全基因组基因表达谱分析是揭示眼睛发育遗传调控网络的有效工具。然而，斑马鱼胚胎眼睛体积较小，难以获取完整且纯净的眼组织用于表达分析。例如，第2至第3天期间眼睛的前后长度仅为约200–300 μm，晶状体直径则小于100 μm。此外，位于视网膜下方的视网膜色素上皮（RPE）仅为单层上皮。尽管可以从整个胚胎中获得基因表达谱，但这些数据无法准确反映特定组织的表达情况。因此，要成功进行眼睛发育的基因表达谱分析，必须获得纯净的组织样本。为解决这一问题，我们建立了一种显微解剖方法，可从1–3 dpf的斑马鱼中分离出完整的视网膜以及附着RPE的视网膜，覆盖了眼球形态发生的主要阶段。所有操作均可在标准体视显微镜下，使用精细镊子和常规实验器材完成。在分离视网膜时，通过刷动操作并利用RPE残留物对培养皿表面的优先黏附性，将单层RPE去除并剥离。而在分离附着RPE的视网膜时，则先消除RPE对解剖皿表面的黏附力，从而使RPE能够完整保留在视网膜上。通过谨慎地提起该组织，可有效分离脉络膜前体和巩膜。在两种情况下，均可使用化学蚀刻的钨针去除晶状体。总之，我们的方法能够获取完整的眼组织，并已成功应用于研究斑马鱼视网膜的组织特异性表达谱。^{1, 2}和视网膜色素上皮³.

方案

第1部分：显微解剖前的准备工作

1. 溶液
   1. E3 培养基⁴（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂ 和 0.33 mM MgSO₄）。
   2. Ringer 溶液^{1, 5}（116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、5 mM HEPES，pH 7.2），经滤膜除菌。
   3. 5N NaOH。
2. 钨针的化学蚀刻
   1. 用黏土将盛有 5N NaOH 的小烧杯固定在培养皿中。
   2. 在烧杯侧壁固定一个回形针，使其与 NaOH 溶液接触。
   3. 将直流电源的负极连接至回形针，正极连接至一段短钨丝（约 2 cm）的一端。
   4. 用一小团黏土包裹钨丝的另一端，并将该端浸入 NaOH 溶液中。
   5. 将电压升至约 3 V，并上下移动钨丝，直至达到理想的蚀刻速率。通常在 10 分钟内可制得高质量的针尖。
   6. 暴露于溶液中的钨丝会逐渐变细。当黏土球脱落时，仍连接正极的一端将形成尖锐的针状结构。
   7. 用 Ringer 溶液或 E3 培养基冲洗针尖，以去除盐类沉积物。

讨论

斑马鱼眼部组织的显微解剖可有效获取完整视网膜以及附有视网膜色素上皮（RPE）的视网膜。这极大地有助于针对特定眼部组织（即视网膜或RPE）的表达研究。事实上，我们已成功利用这些方法获得了全视网膜¹和RPE³的RNA表达谱。这些表达谱的实用性得到了进一步证实：我们近期鉴定出在视网膜分化突变体中发生异常的信号通路和基因家族²。视网膜解剖过程中最关键的步骤是镊子尖端的刷拭操作以及用于去除RPE残留物的组织卷曲动作。我们发现，在解剖过程中将肘部置于可调节的扶手上，可显著稳定手部不必要的移动。此外，部分RPE残留物可能仍存在于锯齿缘区域，这是因为该区域在解剖时无法与培养板的黏附表面接触。尽管如此，在刷拭和剥离操作过程中，大多数RPE细胞已被破坏，这些残留的RPE细胞不太可能保持完整。同时，应在视网膜完整性与RPE清除的彻底性之间取得平衡。在解剖附有RPE的视网膜时，大多数拟似薄而透明膜状的脉络膜和巩膜组织可随皮肤一同剥离。也可通过刷拭组织表面来去除这些残留物，但同样需要在RPE完整性与污染组织清除的彻底性之间取得平衡。我们已成功从1至3天后受精（dpf，即24至72小时后受精）的斑马.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无线研磨杵电机	VWR 国际公司	47747-370
直流电源	Lascar	PSU130	任何直流电源均可使用。不同设备的具体电压需进一步优化。
一次性研杵 && 微量离心管，1.5 mL（无DNase、无RNase、无内毒素）	VWR 国际公司	47747-366	这些用于在TRIzol中收集组织以进行表达分析。
Dumont #5 镊子，尖端尺寸：0.05 × 0.01 mm，不锈钢	World Precision Instruments, Inc.	500341	细尖尺寸是可取的，但并非一成不变，因为可能需要不时对尖端进行修整。
Dumont #5SF 镊子，尖端尺寸：0.025 × 0.005 mm，不锈钢	Fine Science Tools	11252-00	细尖端尺寸是可取的，但并非一成不变，因为可能需要不时对尖端进行修整。
Falcon 聚苯乙烯培养皿，60 × 15 mm	BD 生物科学	351007	这些培养皿用作解剖板。
奥林巴斯 SZX16 体视显微镜	奥林巴斯株式会社	SZX16	任何体视显微镜均可使用。在之前的研究中，我们使用了 Leica 体视显微镜1-3 没有出现任何问题。即使我们安装了2X物镜，也仅使用1X物镜进行解剖操作。
磨刀石	Fine Science Tools	29008-01	如有需要，可用此物修锐镊子的尖端
Thermo板	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	这用于在解剖过程中维持组织的温度，并最大限度减少温度波动对基因表达的影响。我们还将整个显微镜置于温度控制在28℃的环境控制室内°C 在先前研究的解剖过程中1-3 成功率较高。
Trizol，100 mL	Invitrogen	15596-026
直径0.015英寸的钨丝	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
木制涂抹棒	普利丹	807	用于固定化学蚀刻的钨针。