研究视网膜色素上皮生理学与病理生理学的实验模型

摘要

我们提供一种可重复的方法，用于培养人胎儿视网膜色素上皮细胞（hfRPE），使其形成融合的单层细胞，具有成年天然组织的形态学、生理学、极性以及蛋白质和基因表达特征。该研究已拓展至多种眼病的动物模型。

摘要

我们建立了一种细胞培养方法，能够大量生成具有天然人视网膜色素上皮（RPE）形态学、生理学和遗传学特征的原代人胎视网膜色素上皮（hfRPE）细胞融合单层。这些hfRPE细胞培养物表现出明显的色素沉着，电子显微镜显示其顶端膜存在丰富的微绒毛。通过针对多种紧密连接蛋白的免疫荧光标记可识别出连接复合体。这些易于重复的原代培养细胞表现出的上皮极性和功能，与此前研究过的包括人类在内的多种哺乳动物天然RPE模型非常相似。上述结果进一步推动了在多种人类眼病动物模型中开展治疗性干预的研究。我们的研究重点是清除视网膜或视网膜下腔异常积聚液体的策略。细胞外的视网膜下腔分隔了光感受器外节与RPE的顶端膜，对维持视网膜附着以及多种RPE/视网膜相互作用至关重要。

方案

1. 人胎儿组织

所有与人体组织相关的研究均遵循《赫尔辛基宣言》及美国国立卫生研究院（NIH）机构审查委员会的规定。胎眼组织由独立供应商Alameda（加利福尼亚州）的Advanced Bioscience Resources（ABR）公司从妊娠16至22周的随机供体获取，置于ABR提供的含RPMI-1640培养基的试管中，冰上包装，并通过隔夜优先递送服务送达。组织在摘除眼球后最长可保持活性达48小时。

2. 细胞培养基

使用 MEM-alpha 改良培养基（Sigma-Aldrich）作为基础培养基，配制含 5% 和 15% 血清的培养基，用于培养视网膜色素上皮细胞（RPE 细胞）（RPE 培养基；见下表 1）。

名称	Sigma	Gibco	用量	储存条件
MEM, alpha 改良型	M-4526		500 mL	+4°C
N1 添加剂	N-6530		5 mL	+4°C
青霉素-链霉素		15140-148	5 mL	-20°C
GlutaMax - I		35050	5 mL	-20°C
非必需氨基酸	M-7145		5 mL	+4°C
THT*				-80°C
牛磺酸	T-0625		125 mg
氢化可的松	H-0396 10		10 μg
三碘甲状腺原氨酸	T-5516		0.0065 μg
胎牛血清**			5% 或 15%	-80°C

表1. 人胎眼视网膜色素上皮细胞培养基成分（配制500 mL培养基）

* THT 是通过将牛磺酸-氢化可的松-三碘甲腺原氨酸溶解于 1–1.5 mL PBS 中制备而成，随后用于配制培养基。制备多份分装样品并保存于 -80°C，以简化培养基的配制准备工作。

** 胎牛血清并非购自 Sigma-Aldrich 或 Gibco。

培养基制备中使用的胎牛血清购自 Atlanta Biologicals（Norcross, GA）。每瓶血清在使用前均经热灭活处理（56°C，1 小时）。为确保细胞培养的一致性，需购买同一批号的大量血清，并于 -20°C 保存，直至用于培养基的配制。将特定批次的 hfRPE 细胞以低密度接种于 24 孔或 12 孔板中，在含不同批次 20% FBS 的培养基中培养数周。其中生长速度最快、色素化明显且具有典型 RPE 形态（鹅卵石样）的细胞，表明该血清批次适用于细胞培养。

细胞培养基还包含：N1添加剂（Sigma-Aldrich），1:100 mL/mL；GlutaMax/青霉素-链霉素（Gibco），1:100 mL/mL；以及非必需氨基酸溶液（Sigma-Aldrich），1:100 mL/mL。此外，氢化可的松（20 μg/L）、牛磺酸（250 mg/L）和三碘甲腺原氨酸（0.013 μg/L）（THT）需预先配制，将这三种成分溶解于PBS中，得到终浓度为1:500（mL/mL）的溶液。THT分装后保存于80°C，直至加入RPE培养基中使用。

3. 细胞培养

收到完整的眼球后，将其浸入抗生素-抗真菌溶液（稀释至10倍浓度；货号：15240-096；Invitrogen）并加入庆大霉素（1 mg/mL）中，冲洗3至5分钟（如下图1所示）。

图1。孵育后，使用HBSS或PBS等培养基将抗生素冲洗两次。每次将一个眼球转移至涂有Sylgard-184（WPI）的10 cm培养皿中，并用27G针头固定。使用ClearCut侧切口刀（Alcon）在睫状体下方（从眼球赤道至前表面距离的1/3处）的巩膜上做一切口。该切口用于开始环形切割以去除眼球前部组织。此切割操作使用一端带锯齿刃的碳化钨涂层弯虹膜剪刀（FST）完成。在移除眼球前部组织之前，需穿过玻璃体做一切口，以避免在后极部导致视网膜与RPE分离。去除眼球前部后，将后极部置于含5%血清的培养基中，加入dispase-I溶液（2 U/mL，货号：04942086001；Roche Diagnostics, Indianapolis, IN），在37°C、5% CO₂条件下孵育40–60分钟。dispase处理后，将后极部转移至含有硅胶垫（Sylgard 184；Dow Corning, Midland, MI）的HBSS培养皿中，并解剖为四个象限或更大的组织块，以充分展平组织。随后用镊子轻柔去除视网膜。单层的RPE细胞以片状剥离，并直接收集到冷的胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco，#25200-056）中。收集RPE后，将含有组织的胰蛋白酶-EDTA管密封，并置于37°C水浴中孵育10–15分钟。孵育10分钟后，剧烈震荡试管，使RPE细胞分离成小细胞簇。若分离不完全，可将试管再次放回水浴中继续孵育5分钟。胰蛋白酶-EDTA孵育后，检查试管中是否存在未完全解离的混合细胞簇。如有发现，使用细尖玻璃巴斯德移液管将其移除。离心（临床离心机1.4 rpm，4分钟）后，将hfRPE细胞重悬于含15%血清的RPE培养基中，然后接种至Primaria培养瓶中（例如：货号08-772-45；Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）。1天后更换为含5%血清的RPE培养基，之后每2至3天更换一次培养基。3至4周后，细胞达到融合状态且色素分布均匀。此时用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化10至15分钟，重悬于含15%血清的RPE细胞培养基中，并以每孔15万至20万个细胞的密度接种于透明细胞培养小室中（Transwell；Corning Costar, Corning, NY），使用直径12 mm、孔径0.4 μm、聚酯膜材质的插入式培养小室（例如：货号07-200-161，Fisher Scientific）。接种前，每个孔预先包被人细胞外基质（每孔150 μL HBSS中含10 μg，货号：354237；BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ），并在生物安全柜中经紫外光交联固化2小时。在某些情况下，重复胰蛋白酶消化步骤一次，以收集首次消化后未脱落的细胞。采用相同方案（不包括ECM包被步骤）在培养瓶中培养细胞，以获得P1代细胞。实验所用细胞需达到总组织电阻≥200 Ω•cm²，且色素分布均匀。

请点击此处查看放大的图1。

4. 逐步操作流程

1. 准备12孔板并加入多种溶液（每只眼睛需要4个孔）：
   1. 加入10倍抗生素-抗真菌溶液——每只眼睛1孔
   2. 加入PBS/HBSS溶液用于冲洗——每只眼睛2孔
   3. 加入dispase溶液——每只眼睛1孔
2. 准备解剖用培养皿：取出5根固定针，并向其中加入HBSS溶液
3. 取出眼球，将其放入步骤1中配制的抗生素-抗真菌溶液中处理3–5分钟
4. 用步骤1中准备的两孔PBS/HBSS溶液对眼球进行冲洗，然后转移至解剖培养皿中
5. 剪除眼球周围多余的肌肉和结缔组织
6. 使用27G针头将眼球固定（钉入硅胶底座）于解剖培养皿中，使角膜朝上对齐
7. 使用侧切刀在角膜下方做切口，作为环形切割的起始点
8. 使用虹膜剪沿眼球周围进行切割，然后用同一把剪刀剪开玻璃体，并将眼球前部抬起移除。
   注意： 步骤3至8中应避免对眼球施加任何过度的机械压力
9. 将打开的眼球转移至步骤1中准备的dispase溶液中
10. 在37°C、5% CO₂条件下孵育眼杯40–60分钟
11. 将解剖培养皿中的HBSS溶液更换为新鲜溶液
12. 将眼球从dispase溶液中转移至解剖培养皿中
13. 将眼球置于培养皿中（眼杯朝上），并用两根27G针头固定
14. 轻轻抬起部分分离的视网膜，使用视网膜剪将视网膜从视神经处剪下，弃去视网膜
15. 使用虹膜剪从眼球边缘向视神经方向做一条切口
16. 使用全部五根27G针头将眼球展平，使RPE层充分伸展
17. 使用视网膜剪沿视神经周围做环形切割，使RPE层与视神经附着处分离。
    注意： 步骤13–17可在低倍放大下或无需体视显微镜操作
18. 将体视显微镜调节至250倍或更高放大倍数，找到靠近视神经处、沿虹膜剪切口的RPE片层边缘
19. 使用两把镊子将RPE-Bruch膜与脉络膜组织层分离。可能需要多次尝试，以找到RPE与脉络膜连接最弱的区域
20. 将RPE片层放入含冷的胰蛋白酶-EDTA溶液的15 mL离心管中
21. 收集完RPE后，盖紧管盖，并将含有组织的胰蛋白酶-EDTA管放入37°C水浴中孵育10–15分钟
22. 孵育10分钟后，剧烈震荡15 mL离心管，使RPE细胞分离成小细胞团。若分离不完全，将离心管重新放回水浴中继续孵育5分钟
23. 检查离心管中是否存在未完全解离的混合细胞团。若发现任何细胞团，应使用细尖玻璃巴斯德移液管将其移除
24. 以1.4 rpm（临床离心机）离心4分钟，沉淀hfRPE细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于15% RPE培养基中（总体积9 mL）
25. 取3 mL细胞悬液加入Primaria培养瓶中，再加入2 mL新鲜的15% RPE培养基，将培养瓶放入培养箱中过夜（37°C，5% CO₂）

5. 代表性结果

hfRPE 细胞培养的功能验证

在之前的实验中，我们利用这些原代培养细胞确定了质膜转运蛋白的表达、极化和功能，并鉴定了调控视网膜色素上皮（RPE）功能的特定信号通路^1-11。随着这些特征的积累，可形成一组可用于每一代细胞的验证性特性。下文总结的实验明确了决定跨上皮液体转运以及紧密连接通路完整性的相关蛋白。这些in vitro实验已在视网膜再附着的动物模型中得到验证⁶。

图2. CFTR在hfRPE细胞中的定位。 左上方图：使用膜富集提取物在hfRPE细胞中检测到CFTR。M，分子量标记物；第1泳道，主要成熟形式（条带C）和未成熟形式（条带A和B）。中间下方图：CFTR的免疫荧光定位（绿色标记）。右上方图：通过z轴的放大横截面视图，显示沿z轴的最大强度投影。ZO-1（标记为红色）作为紧密连接标记物，界定RPE细胞的顶膜和基底外侧膜。DAPI（蓝色）标记位于基底膜附近的细胞核。ZO-1呈现黄色/橙色，因其红色标记与CFTR的绿色荧光重叠所致。

图3. IFNγ诱导的hfRPE生理变化。 A：向基底侧浴液中添加IFNγ可增加跨上皮液体转运（Jv) 穿过原代培养的人类视网膜色素上皮（hfRPE）细胞单层。 Jv 随时间变化的关系被绘制在图中 上迹线 净液体吸收（从顶端到基底侧浴液）以正值表示；跨上皮电位（TEP）和组织总电阻（R_T）随时间变化的情况显示在下方图迹中。B：向基底侧浴液中加入CFTRinh-172（5 μM）可抑制IFNγ刺激诱导的 Jv 增加。

以下是一个验证hfRPE的动物模型实验示例 体外 结果。在本实验中，向眼表外侧添加IFNg后，人工诱导的视网膜脱离显著减轻（图4 A,B）。该效应可被以下方式部分阻断：（1）加入cAMP阻断剂（图4D）；（2）加入JAK抑制剂后则完全阻断⁺cAMP阻断剂。以下图像使用OCT扫描仪获得。

图4. 体内 视网膜脱离实验。 这些体内实验的步骤此前已有详细描述⁶。在这些实验中，通过向大鼠眼的视网膜下腔（SRS）注射0.5–3 μL经修饰的PBS溶液，单独或联合使用JAK-STAT和PKA信号通路抑制剂，以建立视网膜脱离模型。每次实验在形成视网膜脱离后均设有40–70分钟的初始对照期。在此期间，通过测量水疱体积变化速率以确保水疱稳定。采用光学相干断层扫描成像（俄罗斯科学院应用物理研究所，下诺夫哥罗德，俄罗斯）来监测SRS中体积随时间的变化过程。

通过光学相干断层扫描（OCT）测量再附着过程中体积变化的时间进程。左侧面板（A–D）显示了4项不同实验中添加IFNγ至前表面40–70分钟后脱离区域大小的变化（A、B和D中的箭头所示）。面板A和B显示，IFNγ使Jv从其对照速率（≈ 2 μl•cm⁻²•h⁻¹）增加²•小时^-1) 至 14 和 12 μl•cm²•hr-1，分别。加入JAK-STAT通路和PKA抑制剂后（C和D），IFNγ诱导的吸收速率显著降低至0.2和7.9 μl•cm²•hr-1。箭头指示出与虚线框内区域（起始体积）相比较的胞膜出芽边界。图右侧：上图面板——多次实验测得的Jv速率汇总；中图面板——视频点击此处）；下图- B中实验的3D切片。蓝色伪彩表示加入INFγ后t = 0和40 min时脱离的空间范围。

所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会的声明进行。实验方案已获得美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会的批准。

讨论

在本实验中，我们描述了对先前已发表技术³的进一步改进，旨在简化多个操作步骤，以获得更稳定的原代人视网膜色素上皮（hfRPE）细胞培养，并提高每只眼球可获取的细胞数量。原始操作流程中的每一项改动均通过多项生理学和分子生物学实验进行了严格验证，以确保这些改动不会引入人为假象，并且目前仍被许多其他实验室在使用这些细胞时持续验证。最后，还开展了额外实验，将体外（in vitro）结果与动物模型中的类似干预进行比较。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖实验方案所需的仪器
体视显微镜——任何可用的、具备解剖所需×250工作放大倍数的型号
解剖皿——例如Kimble 100 × 20 mm #23062（每次解剖使用一个），任何来源均可
Sylgard 184 — WPI 货号#SYLG184*
* 制备解剖皿时，请按照Sylgard 184附带的混合说明进行操作，将混合后的液态弹性体倒入培养皿中，形成5–8 mm厚的层。让弹性体固化至少24小时。固化后的解剖皿可用70%乙醇灭菌，并可重复使用多次（约100次）
27 G针头，B-D PrecissionGlide 1¼英寸长度（每次解剖使用5个），任何来源均可
含Ca和Mg盐的HBSS 1×溶液——GIBCO 货号#14025，500 ml（适用于多次解剖）
虹膜剪，碳化钨锯齿刃，弯型——FST 货号#14559-11（一把）
视网膜剪——Katena 货号#K4-5300（一把）
镊子——例如WPI 货号#500085的Dumont #5镊子，尖端抛光（两把）
侧切口刀——Alcon ClearCut 1 mm，双斜面，角度型，货号#8065921540
15 ml离心管——（每只眼球使用一个），任何来源均可
巴斯德玻璃移液管——（每次解剖使用一根），任何来源均可
12孔板——（每次解剖使用一块），任何来源均可
Primaria 25cm2培养瓶——（每只眼球使用2–3个），任何来源均可