我们提供一种可重复的方法，用于培养人胎儿视网膜色素上皮细胞（hfRPE），使其形成融合的单层细胞，具有成年天然组织的形态学、生理学、极性以及蛋白质和基因表达特征。该研究已拓展至多种眼病的动物模型。
本文内容
摘要
摘要
我们建立了一种细胞培养方法，能够大量生成具有天然人视网膜色素上皮（RPE）形态学、生理学和遗传学特征的原代人胎视网膜色素上皮（hfRPE）细胞融合单层。这些hfRPE细胞培养物表现出明显的色素沉着，电子显微镜显示其顶端膜存在丰富的微绒毛。通过针对多种紧密连接蛋白的免疫荧光标记可识别出连接复合体。这些易于重复的原代培养细胞表现出的上皮极性和功能，与此前研究过的包括人类在内的多种哺乳动物天然RPE模型非常相似。上述结果进一步推动了在多种人类眼病动物模型中开展治疗性干预的研究。我们的研究重点是清除视网膜或视网膜下腔异常积聚液体的策略。细胞外的视网膜下腔分隔了光感受器外节与RPE的顶端膜，对维持视网膜附着以及多种RPE/视网膜相互作用至关重要。
方案
1. 人类胎儿组织
所有与人体组织相关的研究均遵循《赫尔辛基宣言》及美国国立卫生研究院（NIH）机构审查委员会的规定。胎眼组织由独立采购方 Advanced Bioscience Resources（ABR，加利福尼亚州阿拉米达）从妊娠16至22周的随机供体获取，置于含RPMI-1640培养基的试管中（由ABR提供），冰上包装，并通过隔夜优先递送服务送达。组织在摘除眼球后48小时内保持活性。
2. 细胞培养基
使用 MEM-alpha 改良培养基（Sigma-Aldrich）作为基础培养基，配制含 5% 和 15% 血清的培养基，用于培养视网膜色素上皮细胞（RPE 细胞）（RPE 培养基；见下表 1）。
| 名称 | Sigma | Gibco | 用量 | 储存条件 |
| MEM, α-修改型 | M-4526 | 500 mL | +4°C | |
| N1 添加剂 | N-6530 | 5 mL | +4°C | |
| 青霉素-链霉素 | 15140-148 | 5 mL | -20°C | |
| GlutaMax - I | 35050 | 5 mL | -20°C | |
| 非必需氨基酸 | M-7145 | 5 mL | +4°C | |
| THT* | -80°C | |||
| 牛磺酸 | T-0625 | 125 mg | ||
| 氢化可的松 | H-0396 10 | 10 μg | ||
| 三碘甲腺原氨酸 | T-5516 | 0.0065 μg | ||
| 胎牛血清** | 5% 或 15% | -80°C |
表1. 人胎盘视网膜色素上皮细胞培养基成分（配制500 mL培养基）
* THT 是在制备培养基前，将牛磺酸-氢化可的松-三碘甲腺原氨酸溶解于 1–1.5 mL PBS 中制成。可制备多份等量分装样品，于 -80°C 保存，以简化培养基的配制过程。
** 胎牛血清并非购自 Sigma-Aldrich 或 Gibco。
培养基制备中使用的胎牛血清购自 Atlanta Biologicals（Norcross, GA）。每瓶血清在使用前均经热灭活处理（56°C，1小时）。为确保细胞培养的一致性，需购买同一批号的大量血清，并于-20°C保存，直至用于培养基的配制。将特定批次的hfRPE细胞以较低密度接种于24孔或12孔板中，使用含不同批次20% FBS的培养基培养数周。其中生长速度最快、色素化程度高且具有典型RPE形态（鹅卵石样）的细胞，表明该血清批次适用于细胞培养。
细胞培养基还包含：N1添加剂（Sigma-Aldrich）1:100 mL/mL、GlutaMax/青霉素-链霉素溶液（Gibco）1:100 mL/mL，以及非必需氨基酸溶液（Sigma-Aldrich）1:100 mL/mL。此外，氢化可的松（20 μg/L），牛磺酸（250 mg/L）和三碘甲腺原氨酸（0.013 μg/L)（THT）通过将这三种组分溶解于PBS中，配制成终浓度为1:500（mL/mL）的溶液，提前制备。THT分装后储存于 80°C 直到加入RPE培养基中。
3. 细胞培养
收到完整的眼球后，将其浸入抗生素-抗真菌溶液（稀释至10倍浓度；货号：15240-096；Invitrogen）并加入庆大霉素（1 mg/mL）中，冲洗3至5分钟（如下图1所示）。
图1。孵育后，使用HBSS或PBS等培养基将抗生素冲洗两次。每次将一个眼球转移至涂有Sylgard-184（WPI）的10 cm培养皿中，并用27G针固定。使用ClearCut侧切口刀（Alcon）在睫状体下方的巩膜处做切口（距眼球赤道至前表面距离的1/3处）。该切口用于开始环形切割以去除眼球前部。此环形切割使用一端带锯齿刃的碳化钨涂层弯虹膜剪（FST）完成。在移除眼球前部之前，需先穿过玻璃体做一切口，以避免在后极部使视网膜从RPE上脱离。去除眼球前部后，将后极部置于含5%血清的培养基中，加入dispase-I溶液（2 U/mL，货号：04942086001；Roche Diagnostics, Indianapolis, IN），在37°C、5% CO2条件下孵育40–60分钟。dispase处理后，将后极部转移至含有硅胶垫（Sylgard 184；Dow Corning, Midland, MI）的HBSS培养皿中，并解剖为四个象限或更大的组织块，以充分展平组织。随后用镊子轻柔地去除视网膜。单层RPE细胞以片状剥离，并直接收集到冷的胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco, #25200-056）中。收集RPE后，将含有组织的胰蛋白酶-EDTA管密封，并置于37°C水浴中孵育10–15分钟。孵育10分钟后，剧烈振荡试管，使RPE细胞分离成小簇。若分离不完全，将试管再次放回水浴中继续孵育5分钟。胰蛋白酶-EDTA孵育后，检查试管中是否存在未完全解离的混合细胞簇。如有发现，使用细尖玻璃巴斯德移液管将其移除。离心（临床离心机1.4 rpm，4分钟）后，将hfRPE细胞重悬于含15%血清的RPE培养基中，然后接种至Primaria培养瓶（例如：货号：08-772-45；Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）。1天后更换为含5%血清的RPE培养基，之后每2至3天更换一次培养基。3至4周后，细胞达到融合状态且色素分布均匀。此时用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化10至15分钟，重悬于含15%血清的RPE细胞培养基中，并以每孔15万至20万个细胞的密度接种至透明细胞培养小室（Transwell；Corning Costar, Corning, NY），使用直径12 mm、孔径0.4 μm、聚酯膜材料的小室（例如：货号：07-200-161，Fisher Scientific）。接种前，小室预先包被人细胞外基质（每孔150 μL HBSS中含10 μg，货号：354237；BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ），并在生物安全柜中经紫外光交联固化2小时。在某些情况下，重复胰蛋白酶消化步骤一次，以收集首次消化后未脱落的细胞。相同的实验流程（不包括ECM包被步骤）用于培养瓶中的细胞扩增，以获得P1代细胞。实验所用细胞需达到总组织电阻≥ 200 Ω•cm2，且色素分布均匀。
4. 逐步操作流程
- 准备12孔板并加入多种溶液（每只眼睛需要4个孔）：
- 加入10倍抗生素-抗真菌溶液——每只眼睛1孔
- 加入PBS/HBSS溶液用于冲洗——每只眼睛2孔
- 加入dispase溶液——每只眼睛1孔
- 打开培养皿，取出5根固定针，并向其中加入HBSS以准备用于解剖的培养皿
- 取出眼球并将其放入抗生素-抗真菌溶液中浸泡3-5分钟（步骤1中已配制）
- 在两孔PBS/HBSS溶液中（步骤1中已准备）冲洗眼球，然后转移至解剖培养皿中
- 剪除眼球周围多余的肌肉和结缔组织
- 使用27G针头将眼球固定（钉入硅胶底面）在解剖培养皿中，调整位置使角膜朝上
- 使用侧切刀在角膜下方做切口，作为环形切割的起点
- 使用虹膜剪沿眼球周围进行切割，然后用同一把剪刀剪开玻璃体，并将眼球前部抬起移除。
注意： 在步骤3至8中，避免对眼球施加任何过度的机械压力 - 将打开的眼球转移至dispase溶液中（步骤1中已配制）
- 在37°C、5% CO2条件下孵育眼杯40-60分钟
- 将解剖培养皿中的HBSS溶液更换为新鲜溶液
- 将眼球从dispase溶液中转移至解剖培养皿中
- 将眼球置于培养皿中（眼杯朝上），并用两根27G针头固定
- 轻轻抬起部分分离的视网膜，使用视网膜剪将视网膜从视神经处剪下，弃去视网膜
- 使用虹膜剪从眼球周边向视神经方向做一条切口
- 使用全部五根27G针头将眼球展平，使RPE层充分伸展
- 使用视网膜剪沿视神经周围做环形切割，将RPE层与视神经附着部分分离。
注意： 步骤13至17可在低倍放大镜下或无需体视显微镜操作 - 调整体视显微镜至250倍或更高放大倍数，沿虹膜剪所做切口靠近视神经处寻找RPE片层的边缘
- 使用两把镊子将RPE-Bruch膜与脉络膜组织层分离。可能需要多次尝试，以找到RPE与脉络膜连接最弱的区域
- 将RPE片层放入含冷胰蛋白酶-EDTA溶液的15 mL离心管中
- 收集完RPE后，盖紧管盖，将含有组织的胰蛋白酶-EDTA管转移至水浴中，在37°C下孵育10-15分钟
- 孵育10分钟后，剧烈震荡15 mL离心管，使RPE细胞分离成小细胞团。若分离不完全，将离心管重新放回水浴中继续孵育5分钟
- 检查离心管中是否存在未完全解离的混合细胞团。如发现细胞团，应使用细尖玻璃巴斯德移液管将其移除
- 离心沉淀（临床离心机1.4 rpm，4分钟），弃去上清液，将hfRPE细胞重悬于15% RPE培养基中（总体积9 mL）
- 取3 mL细胞悬液加入Primaria培养瓶中，再加入2 mL新鲜15% RPE培养基，将培养瓶放入培养箱中过夜（37°C，5% CO2）
5. 代表性结果
hfRPE 细胞培养的功能验证
在先前的实验中，我们利用这些原代培养细胞确定了质膜转运蛋白的表达、极化及功能，并鉴定了调控视网膜色素上皮（RPE）功能的特异性信号通路 1-11 随着这些特性的积累，可形成一组可用于验证每一代细胞特性的属性集合。下述实验鉴定了决定跨上皮液体转运以及紧密连接通路完整性的相关蛋白质。这些 体外 实验已在视网膜再复位的动物模型中得到验证 6.
图2. hfRPE细胞中CFTR的定位。 左上方图： 使用膜富集提取物在hfRPE细胞中检测到CFTR。M，分子量标记；第1泳道，主要成熟形式（条带C） 和未成熟形式（条带A和B）。中间下方图： CFTR的免疫荧光定位（绿色标记）。右上方图： 沿z轴的放大横截面视图，显示沿z轴的最大强度投影。ZO-1（标记为红色）作为紧密连接标记，界定RPE细胞的顶端和基底外侧区域。DAPI（蓝色）标记位于基底膜附近的细胞核。ZO-1呈现黄色/橙色，因其红色标记与CFTR的绿色荧光重叠所致。
图3. IFNγ诱导的hfRPE生理变化。 A：向基底侧浴液中添加IFNγ可增加跨上皮液体转运（Jv) 跨越原代培养的 hfRPE 细胞单层。 Jv 随时间变化的关系被绘制在图中 上迹线 净液体吸收（从顶端到基底侧浴液）以正值表示；跨上皮电位（TEP）和组织总电阻（RT) 随时间变化的情况显示在下方的图迹中。B：加入 CFTRinh-172(5 μM)加入基础灌流液可抑制IFNγ刺激的 Jv 增加。
以下是一个验证hfRPE的动物模型实验示例 体外 结果。在本实验中，向眼表外侧添加IFNg后，人工诱导的视网膜脱离显著减轻（图4 A、B）。该效应可被以下方式部分阻断：（1）添加cAMP阻断剂（图4D）；（2）添加JAK抑制剂后则完全阻断+cAMP阻断剂。以下图像使用OCT扫描仪获得。
图4. 体内 视网膜脱离实验。 这些体内实验的步骤此前已有详细描述6。在这些实验中，通过向大鼠眼的视网膜下腔（SRS）注射0.5–3 μL改良PBS溶液，单独或联合使用JAK-STAT和PKA信号通路抑制剂，诱导视网膜脱离。每次实验在建立视网膜脱离后均设有40–70分钟的初始对照期。在此期间，测量水疱体积变化速率，以确保水疱稳定。采用光学相干断层扫描成像（俄罗斯科学院应用物理研究所，下诺夫哥罗德，俄罗斯）监测SRS中体积随时间的变化过程。
通过光学相干断层扫描（OCT）测量再附着过程中体积变化的时间进程。左侧四组不同实验的OCT图像（图A-D）显示，在前表面加入IFNγ作用40-70分钟后，脱离区域的大小发生变化（图A、B和D中的箭头所示）。图A和B表明，IFNγ使Jv从其对照水平（≈ 2 μl•cm2•小时-1) 至 14 12 μl•cm2•hr-1，分别。在加入JAK-STAT通路和PKA抑制剂（C和D）后，IFNγ诱导的吸收速率显著降低至0.2和 7.9 μl•cm2•hr-1。箭头指示出与虚线框内区域（起始体积）相比较的胞膜出芽边界。图右侧：上图面板——多次实验测得的Jv速率汇总；中图面板——视频点击此处）；下图 - B 中实验的三维切片。蓝色伪彩表示添加 INFγ 后 t = 0 和 40 分钟时脱离的空间范围。
所有动物实验均按照视觉与眼科研究协会的声明进行。实验方案已获得美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会的批准。
讨论
在本实验中，我们描述了对先前已发表技术3的进一步改进，旨在简化多个操作步骤，以获得更稳定的原代人视网膜色素上皮（hfRPE）细胞培养，并提高每只眼球可获取的细胞数量。原始操作流程中的每一项改动均通过多项生理学和分子生物学实验进行了严格验证，以确保这些改动不会引入人为假象，并且目前仍被许多其他实验室在使用这些细胞时持续验证。最后，还开展了额外实验，将体外（in vitro）结果与动物模型中的类似干预进行比较。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢实验室成员 Jeffrey Adijanto、Tina Banzon、Rong Li、Qin Wan、Congxiao Zhang、Jing Zhao、Connie Zhi、Awais Zia 和 Natalia Strunnikova 在表征这些细胞培养物方面提供的帮助。特别感谢 Jing Zhao、Connie Zhi 和 Tina Banzon 在维持大量细胞培养物方面所给予的支持。
本工作由美国国立卫生研究院院内研究计划资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖实验方案所需的仪器 | |||
| 体视显微镜——任何可用的、具备解剖所需×250工作放大倍数的型号 | |||
| 解剖皿——例如Kimble 100 × 20 mm #23062（每次解剖使用一个），任何来源均可 | |||
| Sylgard 184 — WPI 货号#SYLG184* | |||
| * 制备解剖皿时，请按照Sylgard 184附带的混合说明进行操作，将混合后的液态弹性体倒入培养皿中，形成5–8 mm厚的层。让弹性体固化至少24小时。固化后的解剖皿可用70%乙醇灭菌，并可重复使用多次（约100次） | |||
| 27 G针头，B-D PrecissionGlide 1¼英寸长度（每次解剖使用5个），任何来源均可 | |||
| 含Ca和Mg盐的HBSS 1×溶液——GIBCO 货号#14025，500 ml（适用于多次解剖） | |||
| 虹膜剪，碳化钨锯齿刃，弯型——FST 货号#14559-11（一把） | |||
| 视网膜剪——Katena 货号#K4-5300（一把） | |||
| 镊子——例如WPI 货号#500085的Dumont #5镊子，尖端抛光（两把） | |||
| 侧切口刀——Alcon ClearCut 1 mm，双斜面，角度型，货号#8065921540 | |||
| 15 ml离心管——（每只眼球使用一个），任何来源均可 | |||
| 巴斯德玻璃移液管——（每次解剖使用一根），任何来源均可 | |||
| 12孔板——（每次解剖使用一块），任何来源均可 | |||
| Primaria 25cm2培养瓶——（每只眼球使用2–3个），任何来源均可 |
参考文献
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