建立来自啮齿类动物的原代成纤维细胞培养物

摘要

本文介绍了一种从野生啮齿类动物皮肤和肺组织中分离并维持原代成纤维细胞培养物的实验方案。

摘要

在生物学研究中，使用原代细胞而非癌细胞系的重要性正日益受到广泛认可。在细胞周期调控、凋亡和DNA修复等研究中，原代细胞更受青睐，因为癌细胞在参与这些过程的基因中携带突变。由于复制性衰老或非整倍体化的发生，原代细胞无法无限期培养，因此需要定期建立新的培养物。啮齿类动物胚胎成纤维细胞的分离方法已较为成熟，但成年成纤维细胞培养物的分离往往具有挑战性。在将来自人类患者的成纤维细胞与之比较时，从人类疾病小鼠模型中分离的成年啮齿类成纤维细胞可能是更理想的对照。此外，在研究野生啮齿类动物时，若难以获得怀孕雌性个体，则成年成纤维细胞是唯一可获取的材料。本文提供了一种从啮齿类动物皮肤和肺组织中分离和培养成年成纤维细胞的实验方案。我们已成功应用该方法从包括实验室小鼠和大鼠以及海狸、豪猪和松鼠等多种野生啮齿类动物在内的二十多种啮齿类物种中分离出成纤维细胞。

方案

1. 开始前准备

1. 使用70%乙醇对剪刀和镊子进行灭菌。
2. 将小型磁力搅拌子放入30 mL烧杯中，用两层铝箔覆盖后进行高压灭菌。
3. 用无菌水配制28 Wunsch单位/mL的Liberase Blendzyme 3储存液。分装成0.5 mL等份，于-20°C冷冻保存。每次使用前取出新的分装样品解冻。溶液解冻后可能呈现浑浊状态，需涡旋振荡至澄清。
4. 将细胞培养基预热。

2. 动物样本制备

注意：野生动物可能携带病原体，例如狂犬病病毒。务必警惕暴露的锐器。

1. 处死动物并将尸体置于 4°C 环境中。最好立即使用尸体，但如果无法做到（例如动物是在野外采集的），则可在 24 小时内使用。超过 24 小时后，细胞得率会下降。
2. 在手术室或化学通风橱中解剖动物（不得在组织培养超净台中进行）。
3. 腋下区域是采集皮肤样本的便利部位，因为腋下皮肤较薄、脂肪较少，且毛发密度较低。用 70% 乙醇清洁切口部位，并确保毛发完全浸透乙醇。
4. 使用锋利的手术刀在切口周围剃除毛发，剃除范围应大于预期切口区域。尽量避免划伤皮肤。用 70% 乙醇喷洒该区域，然后使其自然干燥。
5. 采集皮肤样本时，切除....

讨论

正常的原代成纤维细胞为生物学研究提供了优良的替代方案，可取代已建立的癌细胞系。成纤维细胞的一个重要优势在于其不携带癌基因和肿瘤抑制基因的突变，并且保持完整的细胞周期检查点。这使得原代成纤维细胞成为研究细胞周期调控、DNA修复以及细胞凋亡的首选体系。本文所述方案提供了一种简单的方法用于原代成纤维细胞的分离与培养。该方案已成功用于从20多种啮齿类动物中分离成纤维细胞。

在进行细胞培养操作时，必须始终保持无菌状态，以避免污染。如果实验室同时培养具有较强侵袭性的癌细胞系（如HeLa细胞），成纤维细胞应与癌细胞分开处理。建议为原代培养物配备专用的生物安全柜和培养箱。

最好将原代细胞培养物维持在3%的生理氧浓度下。大气氧浓度（20%）会缩短培养物的寿命，并增加氧化应激。小鼠成纤维细胞对氧化应激敏感，在20%（大气）氧浓度下培养时，通常在约14次群体倍增后即进入衰老或危机状态。小鼠成纤维细胞可在3%氧浓度下无限期维持²。

务必记录培养细胞的群体倍增次数。大型.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 培养基	Invitrogen	11330-032
胎牛血清（FBS），经鉴定合格	Invitrogen	01437-036	经鉴定合格的血清已预先测试，可为原代成纤维细胞提供良好的生长支持。
抗生素/抗真菌剂	Invitrogen	15420-096
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	替代用酶。
作者说明：由于 Roche 已停产 Liberase Blendzyme 3（货号 11814184001），建议改用 Liberase TM Research Grade 中等热稳定蛋白酶（货号 05401119001，10 mg；货号 05401127001，100 mg）。我们已成功转换使用该酶，未出现任何问题。
EMEM 培养基	ATCC	30-203	ATCC 提供的 EMEM 培养基已含有非必需氨基酸和丙酮酸钠。
带羽毛 #21 一次性无菌手术刀	多家供应商
三气控制培养箱	Forma 或 Heraeus