本文介绍了一种从野生啮齿类动物皮肤和肺组织中分离并维持原代成纤维细胞培养物的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
在生物学研究中，使用原代细胞而非癌细胞系的重要性正日益受到广泛认可。在细胞周期调控、凋亡和DNA修复等研究中，原代细胞更受青睐，因为癌细胞在参与这些过程的基因中携带突变。由于复制性衰老或非整倍体化的发生，原代细胞无法无限期培养，因此需要定期建立新的培养物。啮齿类动物胚胎成纤维细胞的分离方法已较为成熟，但成年成纤维细胞培养物的分离往往具有挑战性。在将来自人类患者的成纤维细胞与之比较时，从人类疾病小鼠模型中分离的成年啮齿类成纤维细胞可能是更理想的对照。此外，在研究野生啮齿类动物时，若难以获得怀孕雌性个体，则成年成纤维细胞是唯一可获取的材料。本文提供了一种从啮齿类动物皮肤和肺组织中分离和培养成年成纤维细胞的实验方案。我们已成功应用该方法从包括实验室小鼠和大鼠以及海狸、豪猪和松鼠等多种野生啮齿类动物在内的二十多种啮齿类物种中分离出成纤维细胞。
方案
1. 开始前准备
- 使用70%乙醇对剪刀和镊子进行灭菌。
- 将小型磁力搅拌子放入30 mL烧杯中，用两层铝箔覆盖后进行高压灭菌。
- 用无菌水配制28 Wunsch单位/mL的Liberase Blendzyme 3储存液。分装成0.5 mL等份，于-20°C冷冻保存。每次使用前取出新的分装样品解冻。溶液解冻后可能呈现浑浊状态，需涡旋振荡至澄清。
- 将细胞培养基预热。
2. 动物样本制备
注意：野生动物可能携带病原体，例如狂犬病病毒。务必警惕暴露的锐器。
- 处死动物并将尸体置于 4°C 环境中。最好立即使用尸体，但如果无法做到（例如动物是在野外采集的），则可在 24 小时内使用。超过 24 小时后，细胞得率会下降。
- 在手术室或化学通风橱中解剖动物（不得在组织培养超净台中进行）。
- 腋下区域是采集皮肤样本的便利部位，因为腋下皮肤较薄、脂肪较少，且毛发密度较低。用 70% 乙醇清洁切口部位，并确保毛发完全浸透乙醇。
- 使用锋利的手术刀在切口周围剃除毛发，剃除范围应大于预期切口区域。尽量避免划伤皮肤。用 70% 乙醇喷洒该区域，然后使其自然干燥。
- 采集皮肤样本时，切除约 1 cm2 的组织片段。用组织镊夹住皮肤，再用剪刀剪取。尽量避免将脂肪层与皮肤一同剪下，因为脂肪会影响胶原酶消化效果。采集肺组织样本时，先用 70% 乙醇清洗胸部区域，然后用剪刀在胸部皮肤上做“T”形切口并掀开皮瓣。用 70% 乙醇清洗暴露的肌肉区域并使其干燥。使用无菌镊子和剪刀剪开肋骨（较大动物可使用骨剪）。操作过程中应采用无菌技术，避免污染内脏器官。不得使用接触过动物毛发的器械触碰内脏器官。使用无菌镊子和剪刀剪取约 1 cm2 的肺组织碎片。
- 将组织碎片放入含有无菌 PBS 的 50 mL 离心管中，以防干燥。
- 用乙醇擦拭装有组织碎片的 50 mL 离心管外壁，并将其转移至组织培养超净台中。
- 按规定妥善处理动物尸体。
3. 提取细胞
- 使用无菌手术刀将组织碎片转移至10 cm细胞培养皿中。转移样品时避免带入过多PBS。
- 使用两把手术刀以剪刀样动作从组织中心开始向外牵拉，将组织切成约1 mm大小的碎块。操作时保持组织团聚，不要逐块切割。当切割充分时，皮肤组织会呈现类似橡皮泥的形态，不会分离成独立碎片，而是能够拉伸变薄。肺组织较易切割，会自然分离成微小碎片。
- 使用手术刀将切割后的组织转移至含有无菌搅拌子的无菌30 mL烧杯中。用10 mL含0.14 Wunsch单位/mL Liberase Blendzyme 3和1×抗生素/抗真菌剂的DMEM/F12培养基冲洗组织切割所用的培养皿，并将冲洗液加入盛有组织碎片的30 mL烧杯中。
- 用无菌铝箔覆盖烧杯，并在以下条件下孵育： 37°C，缓慢搅拌，持续30至90分钟。孵育时间的长短取决于物种和组织类型。注意避免过度消化组织。当消化结束时仍有组织碎片存在的情况下，可获得最佳产量。皮肤组织的消化时间比肺组织更长，大型动物的皮肤消化所需时间更长。消化开始30分钟后进行首次检查，之后每10分钟检查一次。当皮肤消化完成时，消化液变浑浊，皮肤碎片相互分离，碎片边缘呈现“毛糙”状。肺组织消化应在肺碎片颜色由红色变为白色并开始形成黏性纤维时停止。
- 用移液器将含有组织碎片的溶液上下吹打，以打散团块。将溶液转移至无菌的50 mL离心管中。若组织碎片能顺利通过10 mL移液器，则表明切割和消化效果良好。用10 mL温热的含15% FBS、1×抗生素/抗真菌剂的DMEM/F12培养基将烧杯冲洗3次，并将洗涤液加入含有组织碎片的50 mL离心管中。盖紧50 mL离心管，轻轻倒置数次混匀。培养基中的FBS将终止Liberase的消化作用。
- 在摆动桶式组织培养离心机中以524 g离心5分钟。弃去上清液。用10 mL含15% FBS和1×抗生素/抗真菌剂的预热DMEM/F12培养基重悬沉淀。用力吹打悬浮液以充分分散组织块。
- 加入另外30 mL含15% FBS和1×抗生素/抗真菌素的DMEM/F12培养基，混匀后在摆动桶式组织培养离心机中以524 g离心5 min。重复一次，以彻底去除Liberase残留。
- 将沉淀重悬于10 mL含15% FBS和1×抗生素/抗真菌剂的DMEM/F12培养基中，转移至10 cm组织培养皿，置于组织培养箱中培养 37°C，5% CO₂23% O₂2.
- 每天检查培养板中的成纤维细胞及培养基颜色。若分离成功，成纤维细胞将从组织碎片中爬出并贴附于培养板表面（图1）。成纤维细胞通常在2–5天内开始从组织碎片中迁移出来。
- 如果培养基颜色变为黄色，表明可能存在污染或细胞过密。在高倍显微镜下观察培养板。若发现细菌、真菌或蠕虫，应丢弃培养板（实验室动物样本极少出现此类情况，但在野外采集样本时可能发生）。若未发现污染但培养基变色，则可能是由于同一培养皿中细胞或组织碎片过多所致。若培养板中贴壁成纤维细胞覆盖面积超过60%，应更换培养板中的培养基，并将组织碎片转移至含有新鲜培养基的新培养板中。若贴壁成纤维细胞较少，应更换培养基，并将组织块分至2–4个培养板中。
- 7 天后，如果此前未更换培养基，则更换培养基，并将组织碎片转移至含新鲜培养基的新培养板中。
- 将细胞和组织碎片继续培养7天。至第14天时，所有有活力的成纤维细胞均已从组织碎片中迁移出。
- 从细胞分离开始后的第14天，弃去旧的培养基和组织碎片，收集细胞并以5×10⁵个细胞每孔的密度接种于新的培养板中。5 含15% FBS、1×青霉素/链霉素、非必需氨基酸和丙酮酸钠的EMEM培养基。EMEM培养基仅支持成纤维细胞生长，其他细胞类型将死亡或停止增殖。
- 待细胞融合度达到80-90%后，将细胞分装冻存以备后续使用。
- 继续培养细胞，以5x10⁵的密度传代5 细胞汇合度达到80-90%时，每孔细胞数。
4. 代表性结果
正常成纤维细胞是具有明显突起（片状伪足）的大细胞（图2）。成纤维细胞以单层形式生长。健康的增殖培养物中，有1-10%的细胞处于M期，表现为从培养皿表面隆起但仍附着于培养皿的圆形细胞（图3）。通常情况下，接种5×105个细胞的10 cm培养皿在3-4天内达到融合。不同物种间的倍增时间差异较大，某些长寿啮齿类动物的倍增时间可能更长1。当细胞长满培养皿时，其增殖将在G1期停止。典型的融合培养皿中的成纤维细胞形成一层紧密排列的细胞层（图4）。当细胞达到90%融合度时，即可进行传代。如有需要，可通过定期更换培养基（每周一次或两次），将细胞维持在融合停滞状态的培养皿中较长时间。
图1. 小鼠皮肤（A）和肺（B）成纤维细胞的分离。 在第7天拍摄图像前，更换培养基以去除未贴壁的细胞和碎片。
图 2. 小鼠肺成纤维细胞。
图 3. 一视野的小鼠成纤维细胞，包含处于 M 期的细胞，以 10X 放大倍数拍摄。
图 4. 小鼠成纤维细胞融合培养板，以 10 倍放大倍数拍摄。
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讨论
正常的原代成纤维细胞为生物学研究提供了优良的替代方案，可取代已建立的癌细胞系。成纤维细胞的一个重要优势在于其不携带癌基因和肿瘤抑制基因的突变，并且保持完整的细胞周期检查点。这使得原代成纤维细胞成为研究细胞周期调控、DNA修复以及细胞凋亡的首选体系。本文所述方案提供了一种简单的方法用于原代成纤维细胞的分离与培养。该方案已成功用于从20多种啮齿类动物中分离成纤维细胞。
在进行细胞培养操作时，必须始终保持无菌状态，以避免污染。如果实验室同时培养具有较强侵袭性的癌细胞系（如HeLa细胞），成纤维细胞应与癌细胞分开处理。建议为原代培养物配备专用的生物安全柜和培养箱。
最好将原代细胞培养物维持在3%的生理氧浓度下。大气氧浓度（20%）会缩短培养物的寿命，并增加氧化应激。小鼠成纤维细胞对氧化应激敏感，在20%（大气）氧浓度下培养时，通常在约14次群体倍增后即进入衰老或危机状态。小鼠成纤维细胞可在3%氧浓度下无限期维持2。
务必记录培养细胞的群体倍增次数。大型...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 Steven Austad 博士为我们提供了本实验方案的初稿。V.G. 和 A.S. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）及艾利森医学基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 培养基 | Invitrogen | 11330-032 | |
| 胎牛血清（FBS），经鉴定合格 | Invitrogen | 01437-036 | 经鉴定合格的血清已预先测试，可为原代成纤维细胞提供良好的生长支持。 |
| 抗生素/抗真菌剂 | Invitrogen | 15420-096 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05401127001 | 替代用酶。 |
| 作者说明：由于 Roche 已停产 Liberase Blendzyme 3（货号 11814184001），建议改用 Liberase TM Research Grade 中等热稳定蛋白酶（货号 05401119001，10 mg；货号 05401127001，100 mg）。我们已成功转换使用该酶，未出现任何问题。 | |||
| EMEM 培养基 | ATCC | 30-203 | ATCC 提供的 EMEM 培养基已含有非必需氨基酸和丙酮酸钠。 |
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参考文献
- Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
- Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).
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