人类胚胎干细胞向特定细胞类型的定向分化在再生医学领域引起了广泛关注。我们提供了一种简明、逐步的实验方案，用于确定 体内 特定人类胚胎干细胞的命运，为表征用于细胞治疗的组织特异性试剂提供了有价值的工具。
本文内容
摘要
摘要
人类胚胎干细胞（hESCs）具有无限的自我更新能力，并能够分化为源自所有三个胚胎胚层的细胞（1）。将hESCs定向分化为特定细胞类型已在再生医学领域引起广泛关注（例如，（2-5）），以及用于确定细胞分化的in vivo特定或经操作的人类胚胎干细胞（hESCs）的命运对于实现这一目标至关重要。为此，我们改进了一种高效的畸胎瘤形成检测方法。将少量特定筛选的 hESCs 与未分化的野生型 hESCs 及菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris lectin）混合，形成细胞团。随后将该细胞团移植至免疫缺陷小鼠的肾包膜下。仅需低至 2.5 × 105hESCs 需要形成一个 16 cm3畸胎瘤将在8-12周内形成。随后可通过免疫组织化学方法确定最初选定的人胚胎干细胞（hESCs）的分化命运。该方法为表征用于细胞治疗的组织特异性试剂提供了一种有价值的工具。
方案
以下书面方案基于作者已发表的实验参数，并做了一些修改。该方案已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及干细胞研究监督委员会（SCRO）的批准。
一、人类胚胎干细胞（hESCs）的培养
- 在标准的6孔板（孔径3.5 cm）中培养人胚胎干细胞（hESCs）。
- 传代细胞前至少12小时，将小鼠胚胎成纤维细胞（MEF；来源于CF1品系妊娠e12.5天的配种小鼠，经1000 Ci照射处理）接种至涂有1%明胶的培养板上（6,7）。MEF细胞接种密度应为50–60%融合度，或每3.5 cm直径孔接种4 × 105个细胞（图1）。
- 当细胞集落达到约70%融合度时进行传代（图2）。
- 传代时，吸除孔中的KSR生长培养基（6），更换为含有IV型胶原酶的KSR培养基，终浓度为1 mg/ml，每孔加入0.5 ml。
- 将培养板置于37°C、5%CO2条件下孵育5分钟，或直至集落边缘开始从培养板表面翘起。
- 移除IV型胶原酶溶液，每孔加入0.5 ml KSR培养基，手动刮取细胞，使其完全脱离培养板。
- 收集每孔的细胞悬液，转移至15 ml锥形离心管中，静置5分钟，使细胞依靠重力自然沉降。
- 小心吸除上清液，保留细胞及残留培养基，总体积约为300 μl。
- 使用设定为最大体积（200 μl）的微量移液器，轻柔吹打细胞悬液5–6次，以分散细胞集落。
- 用KSR培养基将细胞悬液补至每原代培养孔9 ml终体积（即，若收获1个孔，则离心管中总体积应为9 ml），并加入重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），使其终浓度为12.5 ng/ml。
- 将含有MEF细胞的新培养孔（见步骤2）用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤，彻底去除血清后，每孔加入3 ml上述细胞悬液，置于37°C、5%CO2培养箱中培养。
- 传代后24小时更换含bFGF的KSR培养基，之后每24–48小时更换一次，直至细胞再次达到传代条件。
二、用于移植的 hESC 细胞团制备
- 在移植前24小时，将ROCK抑制剂加入KSR培养基中，使其终浓度为10μM，以提高细胞存活率（8）。一个约70%融合度的细胞孔（约5 × 105个细胞）可制成两个细胞团，每个肾包膜下植入两个细胞团。
- 为准备用于移植的细胞团（9），将经ROCK抑制剂处理的细胞用IV型胶原酶在37°C、5%CO2条件下孵育5分钟。
- 吸除胶原酶IV，加入含10%青霉素/链霉素（pen/strep）的1 ml DPBS替代。
- 手动刮取培养板上的细胞集落，再用额外1 ml含pen/strep的DPBS冲洗孔内，将每份1 ml细胞悬液转移至1.5 ml微量离心管中。
- 将微量离心管短暂离心（8,000 × g），吸除上清液，并将细胞团重悬于500 μl含pen/strep的DPBS中。
- 为帮助细胞在移植时聚集，向每根离心管中加入100 μl含1 mg/ml Phaseolus vulgaris 凝集素（PHA）的DPBS溶液。
- 将细胞与PHA的悬液在室温下孵育5分钟，然后以8,000 × g离心2分钟；将离心管在转子孔中旋转180°，再次以8,000 × g离心2分钟。
- 小心吸除上清液，保留完整的细胞团。
- 用移液器轻轻将200 μl KSR沿管壁靠近细胞团边缘吹打，使细胞团缓慢脱离管壁。
- 一旦细胞团脱离，立即将其转移至置于含3 ml KSR、直径为3.5 cm孔板中的0.4 μm MILLICELL插入式培养插件中，在37°C、5%CO2条件下孵育2小时至过夜。
III. 肾囊膜移植
- 所有动物实验操作均应遵循机构指南，并采用适当的无菌技术进行。
- 麻醉SCID beige小鼠（CB17.Cg-PrkdcscidLyst 背景/Crl)，8–12 周龄，采用吸入 3% 异氟烷/0.5% O2 与腹腔注射三溴乙醇（Avertin；25 mg/kg，新鲜配制）联合麻醉。每只小鼠将使用已描述的技术移植两个细胞团块（10）。
- 将小鼠置于加热垫上以防止低体温，剃除手术切口区域的毛发，然后用氯己定消毒。在偏离中线但与脊柱平行的位置，做一条长约2.5 cm的皮肤切口。
- 用无菌生理盐水保持切口区域湿润，在肋骨下方约1 cm处靠近脊柱的位置，通过肌肉做一个较小的切口。切口大小应恰好足以将肾脏拉出，但又足够小，以确保在无外力作用时肾脏不会滑回腹腔。
- 使用已拉制成钝头、微弯钩状的玻璃巴斯德移液管，轻柔地将肾脏经由肌肉切口拉出。
- 用无菌 DPBS 润湿肾脏，以防止肾包膜干燥。由于肾包膜非常脆弱，此步骤可能需要在操作过程中重复进行。
- 使用Dumont #5镊子轻轻将肾囊从肾脏上提起，并用Vannas弹簧剪进行2 mm切口。
- 使用另一支拉制成极细且末端钝化的玻璃移液管，在肾包膜与肾脏之间制造一个小囊袋。
- 使用连接在一次性移液管上的大孔径移液管吸头，从MILLICELL小室中取出单个细胞沉淀。注意尽量避免带入过多额外培养基，因为过量的培养基可能干扰沉淀的转移。
- 在提起切口边缘以形成囊袋的同时，用移液管轻轻将药丸放置于开口旁，并将其推入囊袋，朝向肾脏的一极。
- 用第二个沉淀重复该过程。将其置于同侧肾脏的包膜下，但位于相对的极部。
- 将胶囊小心地放回沉淀物上。沉淀物应保留在囊袋内，无需缝合即可闭合胶囊。
- 轻轻将肾脏推回腹腔内，使用带反向切割针的4-0丝线缝合线（或更细）缝合肌层。切口应足够小，仅需单针缝合即可闭合。
- 使用相同的缝合材料，用4-5针间断缝合关闭皮肤。
- 将小鼠放回笼子前，分别给予0.05 mg/kg的丁丙诺啡（11,12）和5 mg/kg的酮洛芬（12,13），作为短期和长期镇痛剂。管制类药物的使用应严格遵循机构指南。
- 将动物放回笼中，并置于加热垫上使其从麻醉状态恢复，此过程大约需要20–30分钟。
- 一旦小鼠完全恢复自主活动能力，即可将其送回动物饲养设施。
IV. 畸胎瘤收获、固定与切片
- 术后8至12周时，肾脏附近应出现一个几乎难以触及的畸胎瘤。通常自术后6至8周起，还常会形成较大的液性囊肿。若囊肿引起动物不适，可能需要提前处死动物并取材。然而，由于畸胎瘤的生长速度较囊肿更慢，因此应尽可能等待更长时间，以获得足够大小的畸胎瘤用于分析即至少8周。
- 使用与最初进入肾脏相同的手术方法（见上述第 III 部分，步骤 1-4），将肾脏、畸胎瘤及任何周围囊肿作为一整块组织从腹腔中切除。
- 将切除的全部组织块放入含有10%缓冲福尔马林的试管中。
- 让畸胎瘤在室温下固定过夜 4°C.
- 次日，从管中取出畸胎瘤。剥离所有囊肿及尽可能多的肾组织，注意不要损伤畸胎瘤本身（图3较大的畸胎瘤可切成两半，以利于解剖和包埋。
- 采用标准的石蜡包埋技术处理畸胎瘤。可使用自动化仪器（例如，Shandon Hypercenter）：
一、 80% Flex 酒精 2小时 II. 80% Flex 酒精 1 小时 III. 85% Flex 酒精 1.5 小时 四、 95% Flex 酒精 1 小时 五 100% Flex 酒精 1 小时 六. 100% Flex 酒精 1 小时 七. 100% Flex 酒精 1 小时 八、 Clear-Rite 3 1 小时 IX. Clear-Rite 3 1 小时 X. Clear-Rite 3 1 小时 十一 石蜡（TissuePrep） 2 小时 十二. 石蜡（TissuePrep） 2小时
V. 免疫组织化学与分析
- 将畸胎瘤包埋于石蜡后，使用旋转式切片机切成5μm的连续切片，并将切片漂浮贴附于载玻片上。
- 染色前，将载玻片至少烘烤一小时。
- 采用标准方法对切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，以鉴定代表三个胚层组织结构的切片区域（图4）：
I. 二甲苯洗涤 3-5分钟 II. 二甲苯 3-5分钟 III. 100%乙醇 3-5分钟 IV. 100%乙醇 3-5分钟 V. 95%乙醇 3-5分钟 VI. 80%乙醇 3-5分钟 VII. 水洗（多次换水） 2分钟 VIII. Gill's 苏木精 #3 2-5分钟 IX. 水洗（多次换水） 直至水变澄清 X. Scott's 水溶液（使细胞核变蓝） 3分钟或更长 XI. 水洗（多次换水） 1-2分钟 XII. 伊红Y 1分钟 XIII. 水洗（多次换水） 30秒 XIV. 80%乙醇 1分钟 XV. 95%乙醇 2分钟 XVI. 95%乙醇 2分钟 XVII. 100%乙醇 3分钟 XVIII. 100%乙醇（洁净） 3分钟 XIX. 二甲苯 2分钟或更长 XX. 二甲苯 2分钟或更长 - 使用Permount封片剂为每张载玻片加盖盖玻片。
VI. 代表性结果
图1. 照射处理的CF1小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层用于未分化人胚胎干细胞的培养。MEFs以约50%融合度接种，如图所示，或以每3.5 cm直径孔4 × 105个细胞接种于6孔培养板中。标尺：100 μm。
图 2. 未分化人胚胎干细胞在 MEF 饲养层上亚汇合培养的示例。 人胚胎干细胞在 MEF 饲养层上培养至约 70% 汇合度（如此处所示），然后按所述方法进行传代。标尺为 100 μm。
图 3. 移植后畸胎瘤示例。 畸胎瘤取出后，将畸胎瘤、肾脏及任何附属组织作为一个整体用福尔马林固定，随后在包埋于石蜡前，仔细去除肾脏和附属组织。
图 4. 来自未分化人胚胎干细胞的畸胎瘤在体内包含三个胚层的代表性组织。 将如图 3所示的畸胎瘤进行切片，并用苏木精和伊红染色以鉴定胚胎组织。人胚胎干细胞可生成来源于全部三个胚胎胚层的组织（外胚层（A，B）、中胚层（C）、内胚层（D）。（A）初生神经管结构。（B）原始鳞状上皮。（C）被致密间充质包膜包围的软骨。（D）腺样肠结构。比例尺，100 μm。图像经作者许可转载。
图 5. 畸胎瘤分析可用于追踪标记的未分化人胚胎干细胞（hESC）的命运。 如先前文献报道（9），将特异性标记的 hESC 与未标记的 hESC 混合，可用于在畸胎瘤形成实验中追踪标记细胞的命运。如图所示，表达表面标志物 CD133 并用增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记的未分化 hESC 与未标记的未分化 hESC 混合，通过肾包膜移植法生成畸胎瘤。对苏木精和伊红染色的畸胎瘤切片进行免疫组化分析，使用抗 eGFP 抗体显示 CD133+ hESC 的神经外胚层命运。畸胎瘤的处理方法同 图 4，并用抗 eGFP 抗体（棕色）复染，以定位 CD133+GFP+ 细胞在组织中的衍生物。来源于 CD133+ 的细胞（箭头）出现在源自胚胎外胚层的组织中，特别是神经上皮（左）和新生的类似神经管结构（右）。比例尺：100 μm。图像经作者许可转载。
明胶
- 0.1% 猪源明胶
- 99.9% DPBS
- 将明胶加入DPBS中，37°C孵育1小时或直至明胶完全溶解，使用前经滤膜（0.22μm）过滤除菌。
MEF 培养基
- 10% 胎牛血清（合格认证）
- 90% 达尔伯克改良必需培养基（D-MEM）
- 1x L-谷氨酰胺
- 1x 青霉素-链霉素
- 使用前过滤除菌。
KSR（敲除血清替代物）培养基
- 20% KnockOut 血清替代物
- 80% KnockOut D-MEM
- 1x L-谷氨酰胺
- 1x 非必需氨基酸
- 0.1 mM β-巯基乙醇
- 12.5 ng/ml bFGF
- 过滤除菌。
- 4°C 保存，使用前预热至 37°C。
- 使用前立即加入 bFGF。
胶原酶 IV
- 将1 mg/ml的粉末溶于KSR培养基中，置于37°C下1-2小时，或直至所有粉末完全溶解。
- 过滤除菌。
阿佛丁
- 0.25 g 2,2,2-三溴乙醇
- 0.25 ml 2-甲基-2-丁醇
- 37°C 下孵育过夜，以形成 100% 溶液。
- 手术前数小时，用 DPBS 稀释至 2.5% 工作液，并在 37°C 下孵育至少 1 小时。
- 过滤除菌并分装。
- 三溴乙醇对光极为敏感，因此在制备和使用过程的各个阶段均需避光。
- 应在使用前 12–24 小时内配制，不宜提前过久。
丁丙诺啡
- 甲醇中1 mg/ml的储备液
- 使用无菌H2O稀释至0.015 mg/ml的工作液。
- 于-20°C保存，可保存长达1个月。
酮洛芬
- DPBS 中 0.5 mg/ml 的工作溶液
- 加入 DPBS，37°C 下孵育 1-2 小时或直至所有粉末完全溶解。
- 过滤除菌后，于 4°C 保存。
讨论
我们改进了一种高效的畸胎瘤形成检测方法，用于在体内环境中追踪分化中的人胚胎干细胞（hESCs）的命运。将少量特定筛选的hESCs与未分化的野生型hESCs以及菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris lectin）混合，形成细胞团块。该细胞团块被移植至免疫缺陷小鼠的肾包膜下。随后可通过免疫组织化学方法（图5）确定最初筛选的hESCs的分化命运，如先前研究所述（9）。该方法为识别和制备用于细胞治疗的组织特异性试剂提供了有力工具。
致谢
本工作获得了加州再生医学研究所综合研究资助（RC1-00104）、美国国家心肺血液研究所公共卫生服务资助（HL085377）以及波林基金会向 H.S.B. 提供的捐赠支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-三溴–乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 丝线缝合线 | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| 布托啡诺 | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| 胶原酶 IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 镊子 | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | 肾包膜 |
| 伊红 Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| 胎牛血清（经鉴定） | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex 酒精 | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s 苏木精 #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| 直型止血钳 | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | 普通外科 |
| 虹膜镊 | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | 普通外科 |
| 酮洛芬 | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut 血清替代物 | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL 小室 | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140-050 | |
| 手术剪 | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | 普通外科 |
| 石蜡（TissuePrep） | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| 猪明胶 | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK 抑制剂 | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige 小鼠 | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s 洗涤液 | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas 弹簧剪 | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | 肾包膜 |
| β-巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 |
参考文献
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