为了研究Myxococcus xanthus的群体运动行为，我们设计了一种可针对不同实验进行调整的时间序列显微摄影方案。该方法采用适用于显微观察的标准培养条件，并通过使用廉价且可重复利用的硅胶垫片，获得可重复的实验结果。我们已利用此方法对多细胞趋化性进行了定量分析。
本文内容
摘要
摘要
δ-变形菌Myxococcus xanthus的群体包含数百万个细胞，这些细胞作为一个整体，通过一系列信号协调运动，以响应环境线索，形成复杂而动态的模式。这些模式是自组织且涌现性的，无法通过观察单个细胞的行为来预测。利用延时显微电影追踪分析法，我们鉴定出M. xanthus中一种独特的涌现性模式，称为趋化性，即群体沿营养物质浓度梯度定向移动至其来源的过程1。
为了通过延时显微电影技术高效地表征趋化性，我们开发了一种高度可调节的培养板复合装置（图1），并构建了一个包含8台显微镜的阵列（图2），每台显微镜均能够采集延时视频。该检测方法具有足够的严谨性，可实现可量化数据的稳定重复，所得视频使我们能够观察并追踪群体运动行为中的细微变化。视频采集后，将被传输至一台具备充足内存的分析/存储计算机，以处理和保存数千个视频。该系统的灵活性已被证明对中国台湾M. xanthus研究群体中的多个成员具有重要价值。
方案
所需材料：
- Klett 比色计
- 移液器及吸头
- 2.5 ml 微量离心管
- 微量离心机
- CTTYE 培养基：
- 1.0% Casitone（Difco Laboratories），0.5% 酵母提取物（Difco Laboratories）
- 10.0 mM Tris-HCl（pH 8.0），1.0 mM KH2PO4，8.0 mM MgSO4
- TPM 培养基：
- 10.0 mM Tris-HCl（pH 8.0），1.0 mM KH2PO4，8.0 mM MgSO4
- 琼脂糖
- 设定为 55°C 的水浴锅
- 玻璃显微镜载玻片
- 大型玻璃盖玻片
- 2 x 2 cm，0.5 mm 厚的硅胶垫片（Grace Bio-Lab Inc.）
- Parafilm 封口膜（或标签胶带）
- 镊子
- 小型文件夹夹子
- 微量取样移液器（Fisher）
- 100 μl 一次性玻璃吸头（Fisher）
- 吸水纸（Kimwipes）
第1部分：细胞准备
首先创建一个无菌环境。
- 清洁工作区，戴上手套，并点燃 burner。
- 通过将细胞接种至含有 CTTYE 肉汤的锥形瓶中，并在 32°C 黑暗条件下剧烈振荡培养，启动过夜培养。
- 当培养物密度达到 5 x 108 个细胞/毫升时，用移液器将 1 毫升细胞转移至 2.5 毫升微量离心管中。
- 以 16,000 × g（或最大转速）离心 2 分钟，使细胞沉淀。
- 倾去并弃除上清液。
- 用 1 毫升 TPM（盐平衡、无营养成分培养基）洗涤细胞沉淀。
- 重新悬浮并涡旋振荡
- 再次以 16,000 × g（或最大转速）离心 2 分钟，使细胞重新沉淀。
- 倾去并弃除上清液。
关键步骤
- 使用移液和涡旋振荡相结合的方法，将沉淀完全重悬于 100 μl TPM 培养基中。
重要提示：此步骤确保管中无细胞团块残留。该过程可能需要一定时间。 - 在准备追踪分析平板期间，将细胞置于室温下静置。
第2部分：琼脂制备
- 准备 50 ml 的 TPM（检测培养基）和 CTTYE（营养琼脂）培养基。
- 向每种培养基中加入 0.5 g 琼脂糖（琼脂糖比琼脂的光散射更少）。
- 高压灭菌以实现灭菌。
- 灭菌后，在构建趋迹检测平板复合物时，将培养基置于 55°C 的培养箱（或水浴）中保温。
第3部分：营养盘构建
- 将一个无菌的0.5 mm厚硅胶垫片置于经火焰灭菌的玻璃显微镜载玻片顶部，形成一个小孔。
- 用移液器将约300 μl的55°C CTTYE培养基/琼脂糖加入载玻片上由垫片形成的、含有营养盘的小孔中。CTTYE培养基/琼脂糖应呈隆起状。
- 将一块经火焰灭菌的载玻片（无垫片）盖在CTTYE培养基/琼脂糖上。
重要提示：必须以倾斜角度放置此载玻片，以防止产生气泡。 - 载玻片就位后，用小型长尾夹从两侧夹紧整个组件，每侧一个夹子。
- 将夹好的组件置于4°C环境中，使CTTYE培养基/琼脂糖凝固。通常需要约5分钟。
第4部分：追踪实验准备——建立孔板复合物
组装组件，制备载玻片复合物，放置营养盘，倒入TPM培养基/琼脂糖，分离并干燥培养板复合物，接种细胞，组装追踪分析用培养板复合物。
组装板复合组件
- 针对每个复合物，用火焰灭菌一块玻璃载玻片
- 将一个经高压灭菌的垫圈放置在载玻片上，并置于一旁（灭菌面朝上）。这将构成检测的底部。
- 用火焰灭菌一块玻璃盖玻片，并将其放置在另一块用标签胶带（或Parafilm）包裹的玻璃载玻片上，然后置于一旁（灭菌面朝上）。此载玻片作为支撑，防止盖玻片破裂。这将构成检测的顶部。
- 用火焰灭菌第三块玻璃载玻片，并置于一旁（灭菌面朝上）。该载玻片将用于压平琼脂糖。
重要提示：务必使用镊子用力按压垫圈，确保其与玻璃之间形成密封，否则培养基/琼脂糖可能干涸。
放置营养盘
重要提示：第5至第10步必须一次对一个载玻片复合物进行操作；否则培养基/琼脂糖可能开始凝固，导致成像质量下降。
- 从4°C取出营养盘复合物（第3部分步骤5），将载玻片分开，暴露出已凝固的CTTYE/琼脂糖。
- 使用带有100 μl玻璃一次性吸头的微型取样移液器，从上述CTTYE培养基/琼脂糖孔中取出直径为1 mm的“营养盘”，并将其放入盖玻片密封垫圈所形成的孔中（见上述步骤3）。
倒平板
关键步骤
- 用移液器将约 300 μl 的 55°C TPM 培养基/琼脂糖加入盖玻片上的密封圈所形成的孔中，并覆盖营养盘。TPM 培养基/琼脂糖应呈隆起状。
关键步骤 - 将经火焰灭菌且无密封圈的载玻片（来自步骤 3）盖在 TPM 培养基/琼脂糖上方。
重要提示：必须以一定角度放置该载玻片，以防止产生气泡。
- 待载玻片（来自步骤 5）就位后，使用小型长尾夹从两侧夹紧整个装置。
- 将夹好的装置置于 4°C 环境中，使培养基/琼脂糖凝固。此过程通常需要约 5 分钟。
分离并干燥培养板
重要提示：为防止培养基/琼脂糖干燥，步骤11至20每次仅能对一个载玻片复合体进行操作。
重要提示：为获得最佳结果，步骤11至13应在4°C下进行。
- 待培养基/琼脂糖凝固后，取下文件夹夹，并挤压复合物末端以松开缠有胶带的载玻片。
- 取下缠有胶带的载玻片，将其放置于实验台上以备后续使用。
关键步骤 - 使用镊子作为楔子，将盖玻片/垫圈/培养基/琼脂糖复合物从无垫圈的支撑载玻片上分离，并弃去支撑载玻片。
重要提示：切勿使用撬动方式分离盖玻片/垫圈复合物，否则可能导致盖玻片破裂和/或培养基/琼脂糖黏附在支撑载玻片上。 - 将盖玻片/垫圈/培养基/琼脂糖复合物放置于缠有胶带的载玻片上（垫圈面朝上），并从4°C环境中取出。将该复合物置于火焰旁，使新暴露的培养基/琼脂糖表面可见的水分完全蒸发，时间不超过1分钟。
重要提示：切勿让培养基/琼脂糖干燥过久，否则可能影响M. xanthus的群集行为。
接种细胞
关键步骤
- 当多余水分蒸发后，用移液器将0.5 μl浓缩细胞（第1部分步骤8所得）加到培养基/琼脂糖表面，位置应距离营养盘约1 mm。
重要提示：务必确保移液时将移液器垂直向下移动，然后垂直向上提起。这可保证菌群扩散呈圆形。
重要提示：切勿让移液器枪头接触培养基/琼脂糖表面。否则会在表面形成凹陷，改变M. xanthus菌群的扩散行为。
提示：在接近培养基/琼脂糖前先压下移液器按钮，使细胞液滴预先出现在枪头底部，有助于更准确地释放细胞。 - 细胞接种完成后，将培养装置置于火焰旁，使细胞液滴干燥，时间不超过20秒。
组装检测体系
- 细胞点干燥后，将载玻片/垫片复合物（来自步骤1）与盖玻片/垫片/培养基/琼脂糖/细胞复合物（来自步骤13）上的垫片对齐，并轻轻按压以形成密封。
关键步骤 - 用无尘纸擦拭载玻片和盖玻片表面，去除石蜡膜残留物。完成后的检测装置应与图1相似。
- 擦拭后（步骤15），立即将完成的载玻片复合物放置于维持在32°C的加热载物台上（载玻片朝下，盖玻片朝上），以防止冷凝水形成。若已产生冷凝水，请将载玻片复合物在加热载物台上静置数秒，再启动图像采集软件。
- 选择合适的物镜（2X、4X 或 10X）。
第5部分：影片制备
关键步骤
- 打开相机和显微镜，检查光照强度（确保光线不过强）。启动计算机并打开图像采集程序。
- 点击实时图像窗口并调节显微镜焦距。图像应与图3所示相似，注意观察均匀的琼脂表面。
- 开始采集图像。
关键步骤 - 在最初一小时内定期检查焦距，因为培养基/琼脂容易沉降，导致焦距漂移。
- 清洁工作区域。
- 图像采集完成后，将采集的图像转移至存储设备，并将载玻片组件浸泡于90%乙醇中过夜，以进行拆解。
- 将垫圈进行高压灭菌处理，以便重复使用。
图1. TM平板复合体的示意图。（A）为TM平板复合体的爆炸视图及横截面图。（B）显示使用较大垫圈的情况。
图 2. 显微镜集群。每个显微镜节点（插图）由一台尼康 E400 显微镜、物镜、加热载物台、Insight 相机和一台笔记本电脑组成。各个节点相互联网，并连接至一台主控计算机。其中两个节点配备了荧光成像功能，包括 EXFO 光源和两个 Uniblitz 快门。
图3. 追踪实验装置在时间=0时的20倍放大图像。比例尺，1 mm。
图4. TM培养皿复合体的适应性。（A）M. xanthus在含1.0%琼脂的CTTYE培养基上滑行运动的100倍放大图像。（B）P. aeruginosa在含1.0%琼脂的LB培养基上抽搐运动的20倍放大图像。（C）S. marcescens在含1.0%琼脂的LB培养基上群集运动的20倍放大图像。（B）和（C）均在含1.0%琼脂的LB培养基上进行检测。（D）M. smegmatis在含0.5%琼脂的LB培养基上滑动运动的40倍放大图像。该图像采用图1B所示的替代检测配置拍摄。
视频 1. 群体在追踪实验中受处理的时间延时视频。
视频 2. 一个 M. xanthus 群体的延时视频，其中 1% 的细胞带有荧光标记。通过采集并叠加明场相差图像与荧光图像，以阐明荧光标记细胞在群体中的位置。该视频在 CTTYE 培养基含 1.0% 琼脂上拍摄。
视频 3. M. xanthus 滑行运动的延时视频。该视频在 CTTYE 培养基中含 1.0% 琼脂的条件下拍摄。
视频 4. P. aeruginosa 菌群抽搐运动的时间推移视频。该视频在含有 1.0% 琼脂的 LB 培养基上拍摄。
视频 5. S. marcescens 群集运动的延时视频。该视频在 LB 培养基含 1.0% 琼脂上拍摄。
视频 6. M. smegmatis 滑动运动的延时视频。该视频采用图 1B 所示的替代实验装置，在含 0.5% 琼脂的 LB 培养基上拍摄而成。
讨论
延时显微电影摄影技术（TM）已成为研究原核生物运动性的标准方法2-7。传统上，TM 采用滤纸条、薄层琼脂垫或琼脂块作为基质8-11。当仅需生成用于一般性展示细菌运动的图像序列时，这些方法足够有效且成本低廉。然而，若图像序列需用于生成可重复且定量严谨的数据，则这些方法耗时较长且可靠性有限。例如，人为操作误差导致的技术差异可能引发多种不准确结果，从琼脂表面不平整显著影响被研究细菌的行为，到检测基质一侧与另一侧之间焦平面不一致等问题。为解决这些难题，我们设计了一种 TM 培养皿组件，其具备足够一致的质量，可通过使用廉价且可重复使用的硅胶垫圈实现可重复的实验结果（图 1）。此外，该培养皿组件具有高度可改装性，并已在多种培养基类型和琼脂浓度条件下证实可维持超过一周的充分水合与氧气供应。
为了便于生成延时电影，配备了8台尼康E400显微镜，每台均装配有2X、4X和10X物镜。此外，每台显微镜还配备了一台Insight相机（Diagnostic Instruments, Inc.）和一个加热载物台（20/20 Technologies）。每台相机均连接至一台笔记本电脑，其上已安装高度可定制的图像采集软件SPOT（Diagnostic Instruments, Inc.）。所有这些组件被组装成若干节点，每个节点包含一台显微镜、三个物镜、一台Insight相机、一个加热载物台以及一台控制用计算机。这八个节点通过网络连接组成一个集群，并与一台存储计算机相连，用于汇总、分析和存储该集群生成的延时视频（图2）。该存储计算机配备了一个1TB的RAID系统，以满足集群所产生的大量数据的存储需求。
完成后，将平板复合物置于显微镜的加热载物台上，并启动追踪实验。图像以预设的时间间隔采集，采集频率根据细胞的运动速率确定。例如，单个M. xanthus细胞的移动速度约为每分钟一个细胞长度。若以相同速率（每分钟一张图像）对M. xanthus群体进行成像，则生成的时间序列视频在回放时将呈现平滑的运动效果。图像采集完成后，将图像整合为连续的矩阵序列，并以足够高的帧率回放，使其呈现连续运动的视觉效果（视频1）。该时间序列视频可使用多种软件包进行后续分析。
检测方法的变体。 TM 平板复合装置具有高度可调节性，可用于在多种条件下观察多种不同的微生物。群集运动的观察可通过相差显微镜（记录整个群集作为一个整体的行为）、荧光显微镜（记录已被稀释在非荧光菌群中的单个荧光标记细胞的行为），或两者结合的方式（交替叠加连续拍摄的相差图像与荧光图像）实现（视频2）。该平板复合装置已成功用于生成多种原核生物行为的时间推移视频，包括M. xanthus的滑行运动、Pseudomonas aeruginosa的抽搐运动、Seratia marcescens的群集运动，以及新型的Mycobacterium smegmatis滑动运动（图4及视频3-6）。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得益于美国国家科学基金会职业奖（MCB-0746066，转录激活因子调控涌现行为的表征）对 R.D.W. 的资助。
我们感谢 L. J. Shimkus、B. S. Goldman、G. Suen、M. Singer、L. G. Welch、K. A. Murphy 和 H. G. Taylor 对本文手稿提出的有益讨论和意见。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.0% 胰酪蛋白胨 | Difco Laboratories | ||
| 0.5% 酵母提取物 | Difco Laboratories | ||
| 微量移液器 | Fisher Scientific | ||
| 100 μl 玻璃一次性吸头 | Fisher Scientific | ||
| 2 × 2 cm，0.5 mm 厚硅胶垫片 | Grace Bio-Lab Inc. |
参考文献
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