在录制多细胞行为黏细菌生物膜，使用定时Microcinematography

摘要

研究黏细菌群的行为，我们设计了一个时间推移microcinematography协议，可用于不同的检测修改。它采用的是标准的显微镜适应增长的条件下，使用价格低廉，可重复使用的硅胶垫片，并产生可重复的结果。我们已经用这种方法来量化的多细胞的趋化。

摘要

δ- proteobacterium 黏细菌群包含数以百万计的细胞作为一个集体，协调运动通过一系列信号来创建复杂的，动态的模式，为应对环境线索。这些模式是自我组织和应急，他们无法通过观察单个细胞的行为的预测。使用时间推移microcinematography跟踪检测，我们确定了一个鲜明的新兴模式，在M. xanthus所谓的趋化作用，作为一个群的定向运动了对营养^源 1梯度定义。

为了有效地表征microcinematography趋化通过时间推移，我们开发了一个高度修改板复杂（图1）和建造的8显微镜（图2），每一个能够捕捉时间推移视频集群。检测是严格的，足以让一致的，可量化的数据复制，产生的视频，让我们来观察和跟踪群行为的微妙变化。一旦捕捉到的视频转移到分析/存储计算机与足够的内存来处理和存储成千上万的视频。此设置的灵活性，已证明是有益的几个成员的M. xanthus社会。

方案

用品需要:

• Klett米
• 移液器和提示
• 2.5毫升离心管
• 离心
• CTTYE媒体:
  • Casitone 1.0％（DIFCO实验室），0.5％的酵母提取物（DIFCO实验室），
  • 10.0毫米的Tris - HCl（pH值8.0），1.0毫米的KH ₂ PO _{4，硫酸镁} 8.0毫米
• TPM的媒体:
  • 10.0毫米的Tris - HCl（pH值8.0），1.0毫米的KH ₂ PO _{4，硫酸镁} 8.0毫米
• 琼脂糖
• 置水浴至55 ° C
• 显微镜幻灯片
• 大型盖玻片
• 2 × 2厘米，0.5毫米厚的硅橡胶垫片（格雷斯生物实验室公司）
• 封口膜（或磁带标签）
• 镊子
• 小长尾夹
• 微取样吸管（费舍尔）
• 100μL玻璃一次性提示（费舍尔）
• Kimwipes

第1部分:细胞制备

开始创造一个无菌的环境。

• 清洁工作区，唐手套，光刻录机。

1. 开始接种到含有CTTYE肉汤瓶和大力纷飞在黑暗中32℃孵育过夜培养的细胞。
2. 文化一旦达到了5 × 10 ⁸个细胞/ ml成2.5 ml离心管，吸管1毫升细胞的密度。
3. 16,000 XG（或最大速度）2分钟离心沉淀细胞。
4. 倒出并丢弃上清液。
5. 洗细胞沉淀用1 ml TPM（盐平衡，营养的自由媒体）。
   • 重新挂起和涡
6. 重新颗粒细胞为16,000 XG（或最大速度）2分钟旋转。
7. 倒出并丢弃上清液。
   
   关键的一步
   
   
8. 完全重新悬浮颗粒在100μLTPM的使用相结合的吹打和涡旋媒体。
   
   重要提示:此步骤可确保有没有留在管细胞团块。这可能需要一段时间。
9. 设置在室温下的细胞，预留而准备的跟踪检测板。

第2部分:琼脂的制备

1. 准备50毫升TPM（化验媒体）和CTTYE（营养磁盘）媒体。
2. 添加0.5克琼脂糖（琼脂糖低于琼脂衍射）。
3. 高压灭菌消毒。
4. 灭菌后，媒体保持在55 ° C在孵化器（或水浴），而建设的跟踪检测板配合。

第3部分:营养磁盘建设

1. 火焰灭菌的玻璃显微镜玻片上放置一个0.5毫米厚的无菌的硅橡胶垫片，形成一个小的好。
2. 移液器〜300μL的55 °彗星CTTYE媒体/琼脂糖到以及创建幻灯片上的垫圈和包含的营养磁盘。 CTTYE媒体/琼脂糖应土堆。
3. 将火焰消毒CTTYE媒体/琼脂糖上的幻灯片（无垫片）。
   
   重要说明:这张幻灯片必须设置的角度，以防止形成气泡。
4. 一旦幻灯片到位，钳复杂连同小长尾夹 - 每边一个。
5. 裁剪复杂放置在4 ° C和允许CTTYE媒体/琼脂糖设置。这通常需要大约5分钟。

第4部分:跟踪检测的准备 - 设置板配合物

装配组件，准备幻灯片的复合物，放置营养磁盘，倒入TPM的媒体/琼脂糖，单独和干板复合物，板细胞，并组装跟踪检测板复合物。

复杂的部件组装板

1. 对于每一个复杂的，火焰灭菌玻璃显微镜幻灯片
2. 将幻灯片上的蒸压垫片和预留（消毒端升级）。这将形成检测的底部。
3. 火焰消毒的玻璃盖滑，并将其放置在顶部用标签胶带（或封口膜）包裹的第二个玻璃显微镜幻灯片，并预留（消毒端升级）。这是作为一个支持幻灯片，以防止开裂盖玻片。这将形成检测的顶部。
4. 火焰消毒第三玻璃显微镜玻片上，并预留（消毒端升级）。这将用于扁平化琼脂糖。
   
   重要信息:确保垫片形式按用镊子与玻璃密封，否则媒体/琼脂糖干出来的。

P花边营养磁盘

重要事项:步骤5至10必须做一个幻灯片复杂一次;否则，媒体/琼脂糖开始凝固造成影片质量差。

5. 删除营养磁盘复杂的形式4℃（第5步，从第3部分）和撬除了揭露现在凝固CTTYE /琼脂糖幻灯片。
6. 删除CTTYE媒体/琼脂糖从1毫米直径的"营养磁盘"远高于使用100μL玻璃一次性尖端的微型采样吸管放置在垫片上创建的盖玻片（上述第3步） 。

倒板

关键的一步

7. 移液器〜300μL的55 °彗星TPM媒体/琼脂糖到盖玻片和包含的营养磁盘上的垫片创建。 TPM媒体/琼脂糖应土堆。
   
   关键的一步
8. 将火焰消毒幻灯片没有TPM媒体/琼脂糖上的垫片（从第3步）。
   
   重要说明:这张幻灯片必须设置的角度，以防止形成气泡。
   
   
9. 幻灯片（从第5步）一旦到位，钳复杂连同小长尾夹 - 每边一个。
10. 裁剪复杂放置在4 ° C和允许媒体/琼脂糖设置。这通常需要大约5分钟。

单独和干板

重要信息:要防止干燥媒体/琼脂糖，11到20步，只应在一个幻灯片复杂执行一次。

重要提示:为了获得最佳结果，11到13步，应在4 ° C。

11. 一旦媒体/琼脂糖设置，删除长尾夹，挤压复杂松开胶带包裹的幻灯片。
12. 取下胶带包裹的幻灯片，并进一步使用的长凳上。
    
    关键的一步
13. 使用镊子作为一个楔子，单独从支持幻灯片（无垫片）盖玻片/垫片/媒体/琼脂糖复杂和丢弃的支持幻灯片。
    
    重要事项:不要使用撬议案，独立的盖玻片/垫片复杂。这可能导致在盖玻片打破和/或媒体/琼脂糖坚持支持幻灯片。
14. 放置盖玻片上的胶带包裹的幻灯片/垫片/媒体/琼脂糖复杂（垫圈朝上），删除4 ° C。将这个复杂的刻录机，让所有可见的新暴露的媒体/琼脂糖表面水分蒸发 - 不超过1分钟。
    
    要点:不要让媒体/琼脂糖干太长，因为这可能会影响M。 xanthus群的行为。

板细胞

关键的一步

1. 一旦多余的水分蒸发，吸管集中细胞上的媒体/琼脂糖约1毫米，从营养上（第1部分中的步骤8）0.5μL。
   
   重要提示:这是极为重要，以确保细胞存入移动吸管，直降，然后是直线上升。这将确保群将是圆形的。
   
   重要事项:不要触摸枪头向媒体/琼脂糖这是极为重要的。这将使得表面上的抑郁症和改变行为的 M. xanthus群。
   
   提示:压低在接近媒体/琼脂糖的枪头。这将使细胞下降，出现在吸头的底部，并使其更易于存款细胞。
2. 一旦细胞的沉积，将复杂的燃烧器，让干细胞现场 - 不超过20秒。

组装检测

1. 一旦干细胞当场封面上的防滑垫片/垫圈/媒体/琼脂糖/细胞复合物（从第13步），配合幻灯片/垫片复杂（从第1步），并轻轻按压在一起，形成一个密封。
   
   关键的一步
2. 清洁表面的幻灯片和盖滑与Kimwipe删除左边的封口膜的残留。完成检测应该类似于图1。
3. （滑下放在保持在32℃的加热阶段完成的幻灯片复杂，盖玻片）后立即擦拭（15步），以避免水汽凝结形成形成。如果形成结露，让几秒钟之前开始的图像采集软件幻灯片上加热阶段的复杂坐。
4. 选择适当的目标（2X，4X，或10X）。

第5部分:电影的制备

T"的关键一步

1. 打开相机和显微镜，并检查灯光亮度（确保光线不是太激烈）。启动电脑，然后打开图像采集程序。
2. 点击实时图像窗口和聚焦显微镜。图像应该出现类似如图3所示的。请注意，琼脂表面均匀。
3. 开始获取图像。
   
   关键的一步
4. 定期检查的重点，在第一个小时，媒体/琼脂往往解决造成焦点漂移。
5. 干净的工作区域。
6. 一旦完成图像采集，传输收购存储图像，并打破90％的乙醇浸泡过夜幻灯片复杂。
7. 高压灭菌器垫片重用。

图1。TM板复杂的卡通插图。 （A）给出了在爆炸视图和断面的基本TM板复杂。 （b）显示了较大的垫圈使用。

图2。显微镜集群。每个显微镜节点（插图）由尼康E400显微镜，目标，激烈的阶段，透视相机，笔记本电脑。每个节点通过网络连接在一起，并链接到主控制器的计算机。两个节点的设立与EXFO光源和两个Uniblitz百叶窗组成的的荧光功能。

图3。20X的跟踪检测仪器的图像在时间= 0 。比例尺，1毫米。

图4。TM板复杂的适应性。 （一）M. 100X形象xanthus滑翔运动的CTTYE在1.0％的琼脂。 （二）P. 20X形象假单胞菌抽搐蠕动。 （三）20倍影像S.沙雷氏菌蜂拥蠕动。 （二）及（C）测定在1.0％琼脂的LB。 （四）M. 40X形象耻垢的LB滑动在0.5％的琼脂蠕动。使用替代实验配置图1B看到此图片被抓获。

视频1。一个时间推移视频跟踪检测群。

视频2。一个M.时间推移视频xanthus群，其中1％的细胞荧光标记。被抓获的交替阶段，对比和荧光图像和覆盖澄清荧光细胞群内的位置。 CTTYE在1.0％的琼脂，该视频被抓获。

视频3。M 的时间推移视频xanthus滑翔运动的。 CTTYE在1.0％的琼脂，该视频被抓获。

一个P 的时间推移视频视频4。 假单胞菌抽搐蠕动。该视频被抓获就在1.0％琼脂LB。

S 的 ​​时间推移视频视频5。 沙雷氏菌蜂拥蠕动。该视频被抓获就在1.0％琼脂LB。

M 的时间推移视频录象6。 耻垢滑动蠕动。该视频被抓获使用替代实验配置图1B看到LB在0.5％的琼脂。

讨论

定时microcinematography（TM）已经成为一个标准的方法来研究原核蠕动^2-7。传统上，商标是由基板^8-11使用滤纸芯，薄琼脂垫，或琼脂砖。这些方法是适当和符合成本效益的，使用时为一般细菌运动插图产生的图像序列。但是，如果图像序列的结果必须产生重复性好，定量严谨的数据，这些方法都是费时又有点不可靠。例如，人为错误造成的这些技术的变化可能导致各种各样的不准确之处，在琼脂表面的不规则，可显着影响细菌的行为正在研究从一个侧面的检测基板在焦平面的差异其他。要解决这些问题，我们设计了一个TM板复杂的足够一致的质量，产量可重复性的结果，由用人硅胶垫片，价格低廉，可重复使用（图1）。此外，盘复杂的是高度修改和已被证明是保持水分和足够的含氧超过一个星期通过多种媒体类型和琼脂浓度。

为了方便的生成时间推移电影，8尼康E400显微镜2X，4X和10X的目标，每个配备。此外，每个显微镜透视相机（诊断仪器公司），和一个加热阶段（20/20技术）收购了。每个摄像机连接到笔记本电脑上已安装的高度修改的图像采集软件的SPOT（诊断仪器公司）。所有的各种元...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.0% Casitone	Difco Laboratories
0.5% 酵母提取物	Difco Laboratories
微量采样移液器	Fisher Scientific
100 μl 一次性玻璃吸头	Fisher Scientific
2 x 2 cm，0.5 mm 厚硅橡胶垫圈	Grace Bio-Lab Inc.