一种通过球形化、渗透裂解和蔗糖密度梯度超速离心法分离Francisella tularensis内膜和外膜的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
Francisella tularensis是一种革兰氏阴性胞内球杆菌，是人畜共患病土拉菌病的致病菌。与其他细菌病原体相比，其极低的感染剂量（<10 CFU）、疾病进展迅速以及高发病率和死亡率表明，该菌的致病菌株具有显著的毒力Francisella编码新型毒力因子。表面暴露的分子，即外膜蛋白（OMPs），已被证明可促进细菌与宿主细胞的结合、侵入、胞内存活、毒力及免疫逃逸。研究OMPs的重要性还在于它们可作为多种细菌性疾病的保护性疫苗。尽管可以通过整体膜提取技术（包括细胞超声处理后进行离心和/或去污剂提取）从革兰氏阴性菌中提取OMPs，但这些制备物常被周质和/或细胞质（内）膜（IM）污染物所污染。多年来，生化与生物物理分离革兰氏阴性菌内膜与外膜（OM）的“金标准”方法是将细菌进行球状体化和渗透裂解，随后进行蔗糖密度梯度离心。一旦在蔗糖梯度上分层，OM可根据其浮力密度与IM分离，这种差异主要归因于OM中存在脂多糖（LPS）。在此，我们描述一种严格且优化的方法，用于提取、富集和分离F. tularensis外膜及其相关的外膜蛋白（OMPs）。
方案
第1天：F. tularensis 平板接种
- 接种冻存菌种 F. tularensis 接种于补充有2.5%（体积/体积）供体小牛血清、2%（体积/体积）IsoVitaleX、0.1%（重量/体积）葡萄糖和0.025%（重量/体积）焦磷酸铁的Mueller-Hinton琼脂上培养 F. tularensis 在 37°C 含5% CO2 约 24 小时。
第2天：F. tularensis 液体培养基接种
- 制备1升阳离子调节的Mueller-Hinton培养基（含1.23 mM二水合氯化钙和1.03 mM六水合氯化镁），并进行高压灭菌。冷却至37°C后，向培养基中补充0.1%（wt/vol）葡萄糖、0.025%（wt/vol）焦磷酸铁以及2%（vol/vol）IsoVitaleX。使用0.22 μm滤器将培养基过滤除菌，并分装为两份500 ml的等份。
- 取出12 ml添加了补充成分的Mueller-Hinton培养基，转移至一个无菌的50 ml Falcon管中。
- 使用无菌的10 μl接种环，从琼脂平板（第1天培养）上刮取大量F. tularensis菌落，转移至12 ml Mueller-Hinton培养基中（见步骤2）。反复吹打溶液以打散菌团，制备均一的细菌悬液。切勿涡旋振荡。
- 使用无菌移液管，将步骤3所得的5 ml细菌悬液接种至每个500 ml容器中。在37°C下以轻度振荡（New Brunswick Innova 2300系列摇床，190–200 rpm）培养14至18小时。
第3天：原生质体制备、渗透裂解及蔗糖密度梯度离心
- 获取 F. tularensis 从摇床培养箱中取出培养物，从每份500 ml培养液中移取1 ml样品，测定各自的光密度。我们发现，在以下条件下可获得最佳的膜蛋白提取与分离效果 F. tularensis 对数生长期初期的细胞，这与OD值相关600 0.2 到 0.4 之间（约 107 至 108 CFU/ml）。培养物的 OD600 小于0.2将无法获得足量的总膜材料用于后续蔗糖梯度离心。相反，OD值过高的培养物600 大于 0.4（接近稳定期）时已被发现会产生混合膜融合。
- 7,500 x g 离心培养物 g 30 分钟 15°C 收集细胞。我们建议将培养物分装至四个250 ml离心瓶中进行离心，这有助于后续沉淀的重悬。
- 小心移除每个离心瓶中的培养基上清液，并将瓶子在吸水材料上轻轻敲击，以去除多余的培养基。
- 离心结束后10分钟内，将每个细菌沉淀重悬于8.75 ml 0.75 M蔗糖溶液（含5 mM Tris，pH 7.5）中。四个细菌沉淀应在10分钟内全部重悬并转移至一个无菌的250 ml烧瓶中（内含一个小搅拌子），总体积为35 ml细菌悬液。
- 在搅拌器上轻轻混匀细胞悬液的同时，于10分钟内缓慢加入70 ml（2倍体积）的10 mM EDTA二钠溶液（溶于5 mM Tris，pH 7.8）。加样时，将移液器吸头置于细胞悬液液面以下，以避免EDTA局部浓度过高。搅拌子的转速应足以充分混匀细胞悬液，但不可过快，以防产生泡沫或气泡。加入EDTA溶液后，于室温孵育30分钟。
- 孵育30分钟后，缓慢加入11 ml（1/10）th 2 mg/ml 溶菌酶溶液的体积，使其终浓度达到 200 μg/ml继续在加入溶菌酶溶液期间混合细胞悬液。如上所述，应将移液枪头置于细胞悬液液面以下加入溶菌酶溶液，以避免溶菌酶局部浓度过高。溶菌酶储存液（2 mg/ml）可分装为单次使用 aliquot，保存于 -20°C 孵育三到四个月。将所得溶液在室温下孵育30分钟。
- 在30分钟孵育期间，准备一个带有小型搅拌子的无菌1 L烧瓶，并加入530 ml室温的Cellgro Molecular Grade dH₂O2O（4.5 体积）
- 通过缓慢稀释（流速约为 11 ml/min）将细胞悬液（来自步骤 6）加入 530 ml 分子生物学级 dH₂O 中，进行渗透裂解2O（自第7步起）在10至15分钟内轻柔混匀。由于此步骤中溶液体积较大，需提高搅拌子转速以确保充分混合。搅拌子的旋转速度应足以在细胞悬液加入dH₂O后将其彻底分散。2O，但速度不宜过快，以免产生泡沫或气泡。将移液管管尖抵住烧瓶底部、靠近搅拌子的位置加入细胞悬液，以促进细胞悬液均匀稀释。我们发现此步骤使用25 ml移液管效果最佳。仔细观察稀释过程，并根据需要调节流速，以分散局部聚集的细胞、细胞团块和细胞丝状物。将所得溶液在室温下孵育30分钟。请注意，此步骤似乎是整个实验成功最关键的环节之一。
- 30分钟孵育后，将40 ml渗透裂解液分装至50 ml锥形管中，在7500 × g离心30分钟，温度为 10°C 去除完整细胞和碎片。
- 离心后，从每个锥形管中小心移除27至30 ml上清液，并将上清液汇集至无菌的1 L烧瓶中
- 将25 ml混合上清液分别转移至16支超速离心管中，在200,000 x g （在F50L-8x39 FiberLite超速离心转子中以44,400 rpm离心2小时） 4°C注意每个转子可容纳8支试管，因此此步骤需要两个转子和两台超速离心机。或者，可将第二组8支试管暂时存放于 4°C 直至离心。
- 超速离心运行结束后10分钟内，配制改良膜重悬缓冲液。取8 ml膜悬浮缓冲液（25% [wt/wt]蔗糖，5 mM Tris，30 mM MgCl₂）2) 转移至无菌离心管，加入1片不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物和375 U的苯并核酸酶。轻轻混匀溶液，使蛋白酶抑制剂片剂溶解。
- 超速离心后，小心倾倒上清液，将超速离心管倒置在吸水材料上，并轻轻敲击管壁以去除多余的上清液。用记号笔标记每个膜沉淀的位置，以便于观察。轻柔地用 600 μl 每份加入改良的膜重悬缓冲液。将每份膜重悬液转移至下一组八个离心管中，轻轻重悬这八个沉淀，然后将所得的膜重悬液汇集至一个无菌离心管中。沉淀的膜较难重悬，因此需持续将改良的膜重悬缓冲液反复过膜沉淀，直至其从管壁脱离。通常需要用移液器吸头刮下附着在管壁上的膜沉淀，以辅助重悬过程。移液时应避免产生泡沫或气泡。请注意，此步骤似乎是整个实验成功最关键的环节之一。
- 当所有16个管中的膜沉淀已重悬并移出后，每四个管用 600 μl 加入改良的膜重悬缓冲液。洗涤应集中在每根试管的标记区域（膜沉淀）周围。将洗涤液转移至膜重悬试管中。对剩余的三组四根试管重复上述洗涤步骤。
- 将膜重悬液在室温下轻轻摇动孵育30分钟，以降解DNA并有助于减少絮状物质。
- 取出少量膜悬液，进行蛋白质定量，以确定总膜产量。我们通常制备未稀释、1:1稀释（在2.5% SDS中）和1:3稀释（在2.5% SDS中）的膜样品，并将样品在 90°C 孵育10分钟，使用BioRad DC蛋白质检测试剂盒测定膜重悬液中的蛋白质浓度。总蛋白得率通常在1.0 mg/ml至1.6 mg/ml之间。必须使用加热和SDS处理以从提取的膜中释放外膜蛋白（OMPs），从而获得更准确的蛋白质定量结果。
- 通过以下步骤制备线性蔗糖梯度：将蔗糖溶液（质量分数，溶于5 mM EDTA，pH 7.5）按下列顺序逐层加入14 x 95 mm Ultra-Clear超速离心管中，每层1.8 ml：55%、50%、45%、40%、35%、30%。使用带橡胶头的移液器（而非自动移液器）进行蔗糖梯度的逐层叠加操作更为简便。
- 根据膜重悬液的蛋白定量结果（步骤16），在每个梯度上层加入1.5 mg膜重悬液。每个14 × 95 mm超速离心管的最大容量为12.5 ml，考虑到步骤17中蔗糖溶液已占10.8 ml，每管加入的膜重悬液体积不应超过1.7 ml。分别称量各蔗糖梯度管，并通过添加或移除膜重悬液仔细调节每管的最终重量，使所有离心管重量一致（± 0.01 g）。
- 将蔗糖梯度转移至SW-40Ti 摆动桶转子中，在256,000 x g （38,000 rpm）下离心至少17小时 4°C.
第4天：蔗糖梯度组分的收集
- 离心17小时后，停止离心，小心地从SW-40Ti转子中取出蔗糖梯度管。
- 用70%乙醇小心清洁蔗糖梯度管底部，用21号针头刺穿管底，将梯度液依次分步收集到无菌微量离心管中，每管500 μl。对后续梯度管重复此操作。应让梯度液依靠重力自然滴落，以避免扰动蔗糖梯度。然而，若梯度管底部停止滴液，可用手指对管顶施加轻微压力以促进流出。
- 使用折射仪测定每个蔗糖梯度组分的折射率，并将折射率与g/ml单位下的特定密度进行对应1。通过选取代表性蔗糖梯度组分（密度间隔0.01，范围从1.11 g/ml至1.26 g/ml）进行SDS-PAGE分离、转膜至硝酸纤维素膜及免疫印迹分析，以评估蛋白质的定位情况。
代表性结果
若操作正确，该方法可实现F. tularensis A型（如SchuS4）和B型（如LVS）菌株中内膜（IM）和外膜（OM）囊泡的完全分离。如图1所示的代表性免疫印迹结果，F. tularensis的外膜蛋白（OMPs）分布于密度为1.17至1.20 g/ml的区段，而内膜蛋白（IMPs）则分布于密度为1.13至1.14 g/ml的区段。
图 1. F. tularensis 蔗糖密度梯度的免疫印迹分析。从梯度中逐级收集组分，并根据折射率计算密度（g/ml）。蛋白质通过 SDS-PAGE 分离后转移至硝酸纤维素膜，进行免疫印迹以检测外膜蛋白（OMP）和内膜蛋白（IMP）的分布情况。mw：预染分子量标准，大小（kDa）标注于每张印迹图左侧。LVS：F. tularensis LVS 的全细胞裂解物。各泳道上方标注了相应的蔗糖梯度组分密度。如左侧边注所示，OMP 和 IMP 使用多克隆、单特异性抗血清进行检测。F. tularensis SchuS4 也获得了类似结果。
讨论
本方案描述了一种对球状体化、渗透裂解及蔗糖密度梯度离心这一“金标准”方法的改良，用于从其他细胞组分中物理分离并富集革兰氏阴性菌的外膜 2, 3, 4. 此前我们已描述过该方法用于分离A型和B型菌株的OMs F. tularensis 5，本演示提供了一种更为详细且优化的外膜分离方案。这对于鉴定这种致命病原体可能暴露于表面并具有毒力因子特征的蛋白具有重要意义。本方法的重要性已在本实验室的研究中得到证实：用纯化的外膜蛋白对小鼠进行免疫，可显著抵御强毒A型菌株的攻击 F. tularensis 肺部激发 6如上所述，细菌细胞的生长阶段、渗透裂解过程中的仔细监测以及膜沉淀的轻柔重悬，是影响该膜分离实验成败的关键步骤。尽管该优化方法较为严谨且存在一定的实验差异性，但所获得的外膜纯度显著提高，优于使用去垢剂、氯化锂或碳酸钠所获得的外膜。 7, 8, 9, 10, 11, 12.
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本项目由美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）/美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 P01 AI055637 和 U54 AI057156。本项目的全部内容仅由作者负责，不一定代表 RCE 项目办公室、NIAID 或 NIH 的官方观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 供体小牛血清 | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro 分子级 dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml 聚碳酸酯瓶 | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 超速离心转子 | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Group | 04693132001 | |
| 苯并核酸酶（Benzonase） | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC 蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95 mm 离心管 | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti 摆桶转子 | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe 台式折射仪 | Fisher Scientific | 13-964-10 |
参考文献
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