方法文章

Neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析

20.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/2045

⸱

2010年10月24日

 , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Bristol, UK

本文内容

摘要

Neisseria meningitidis（Nm）是一种仅感染人类的革兰氏阴性呼吸道病原体，能够与人类α-辅肌动蛋白结合。本文介绍了一种在细菌侵入人脑微血管内皮细胞（HBMECs）后，可视化细菌与细胞内α-辅肌动蛋白共定位的实验方案。

摘要

脑膜炎奈瑟菌（Nm，脑膜炎球菌）的 Opc 蛋白是一种表达于表面的完整外膜蛋白，可作为黏附素和有效侵袭素，介导对人类上皮细胞和内皮细胞的侵袭。我们已鉴定出内皮细胞表面定位的整合素是 Opc 的主要受体，该过程需要 Opc 首先结合整合素配体（如玻璃粘连蛋白），再通过这些配体与细胞表达的受体结合1。此过程可导致细菌侵入内皮细胞2。最近，我们观察到 Opc 与人类细胞全细胞裂解液中一种 100 kDa 蛋白之间存在相互作用3。最初，我们在将电泳分离并转印至硝酸纤维素膜上的宿主细胞蛋白与表达 Opc 的 Nm 重叠孵育时，观察到该相互作用。该相互作用是直接的，不涉及中间分子。通过质谱分析，我们确定该蛋白为 α-辅肌动蛋白。由于在所检测的八种细胞系中均未发现表面表达的 α-辅肌动蛋白，且 Opc 在血清存在下与内皮细胞相互作用可导致细菌进入靶细胞，因此我们进一步探讨了这两种蛋白在细胞内相互作用的可能性。为此，我们用表达 Opc 的 Nm 长时间感染培养的人脑微血管内皮细胞（HBMECs），并通过共聚焦显微镜观察内化细菌与 α-辅肌动蛋白的定位情况。我们观察到，随着细菌内化时间的延长，Nm 与细胞骨架蛋白的共定位逐渐增加，在细菌内化 8 小时后共定位程度显著。此外，利用定量成像软件，我们能够获得 Nm 与 α-辅肌动蛋白及其他细胞骨架蛋白共定位的相对定量数据。本文介绍了一种在细菌进入人内皮细胞后，对细菌与细胞内蛋白共定位进行可视化和定量的实验方案，该方法同样适用于人上皮细胞。

方案

1. 免疫荧光实验方案

铺板、感染与免疫染色

以下操作步骤需要具备适当安全级别的组织培养和微生物学实验室设施。

第1天

A. 感染用靶细胞的制备

  1. 将HBMEC以50%汇合度（约1.5×104 个细胞/cm2）接种于置于12孔板（每孔生长面积为3.8 cm2）中的玻璃盖玻片（直径16 mm）上。

    生长培养基：RPMI 1640，添加15%热灭活（56 °C，30分钟）胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL青霉素/链霉素、1%（v/v）MEM非必需氨基酸溶液和1% MEM维生素溶液。
  2. 在37°C、5% CO2培养箱中培养过夜（O/N）。

B. 细菌培养

  1. 在所需培养基（例如补充10%加热马血的脑心浸液（BHI）琼脂平板）上，于37°C、5% CO2条件下培养目标菌株过夜（16–18小时）4。

第2天

A. 细菌（N. meningitidis）悬液的制备

  1. 使用10 μL接种环，将过夜培养的细菌培养物悬浮于2 mL PBSB（含钙和镁的PBS）中。
  2. 将悬浮液在室温（RT）静置5分钟，使较大的细菌聚集体沉降。
  3. 在不扰动沉淀的前提下，将上层1 mL悬浮液（储备接种物）转移至无菌试管中。
  4. 为估算储备接种物中的细菌数量，取等分试样（20–50 μL）加入含有1 mL 0.1 M NaOH中1% SDS的试管中，轻轻混匀以溶解细菌。
  5. 通过测定260 nm处的吸光度（A260）来测定溶液中核酸含量。据我们实验经验，A260为1时相当于5×108 菌落形成单位/mL（cfu/mL）。可通过将储备接种物用PBSB进行系列稀释，涂布于琼脂平板，经过夜培养后计数菌落，以验证该换算关系。
  6. 将储备接种物的等分试样用感染培养基［M199培养基添加2%去补体（56°C，30分钟）的正常人血清（NHS）］稀释，以获得感染靶细胞所需的细菌密度。
    1. 在我们实验室中，通常采用每个靶细胞200–300个细菌的感染比例。

B. 细胞培养感染

  1. 用 Hank's 培养基将接种有靶细胞的盖玻片洗涤 3 次，以去除任何残留的抗生素。
  2. 在 37°C、5%CO2 条件下，用新鲜制备的细菌悬液（如上所述）感染细胞 3 至 8 小时。
  3. 感染结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，并在 500 μL 的 2% 多聚甲醛（PFA）中于室温固定 30–45 分钟，或于 4°C 过夜。
    1. 上述浓度和时间的多聚甲醛固定被证明适用于保持细菌和细胞形态。
  4. 去除多聚甲醛后，将固定好的细胞在含 0.1% Triton X-100 的 PBS 中孵育 10 分钟，以进行透化处理。
  5. 用 PBS 将样品洗涤 3 次。
  6. 随后进行免疫染色，或 alternatively 将样品置于 500 μL 的 1% BSA/PBST 中，于 4°C 过夜保存。

第3天

免疫染色

通过使用适当的一抗和二抗，可依次或同时对细胞内细菌和α-肌动蛋白进行染色，具体步骤如下：所有操作均可在12孔板中进行。

  1. 用 500 μL 含 0.05% Triton X-100 的 3% BSA/PBST（PBS 缓冲液）在室温下封闭载玻片上的通透细胞，封闭时间为 30–60 分钟。
  2. 用 PBS 洗涤后，将每张载玻片转移至 12 孔板中的一个新的干燥孔中。
  3. 加入针对细菌和 α-肌动蛋白的初级抗体；每张载玻片加入 80 至 100 μL 抗体，小心滴加以完全覆盖载玻片表面即可。室温孵育 1 小时。
    1. 我们同时使用了兔多克隆抗血清（实验室制备）针对 Neisseria meningitidis 以及小鼠单克隆抗体（mAb）针对 α-肌动蛋白（Abcam）。在某些实验中，以抗肌动蛋白或波形蛋白的单克隆抗体（Sigma）替代抗 α-肌动蛋白抗体。
  4. 孵育结束后，在孔中加入 200 μL PBS，小心提起载玻片并转移至含有 500 μL PBS 的新孔中。
  5. 5 分钟后，用移液器吸除 PBS，然后加入新鲜 PBS。重复此洗涤步骤两次。将载玻片转移至新的干燥孔中。
  6. 加入用 1% BSA/PBST 稀释的相应偶联不同荧光染料的二抗；室温避光孵育 1 小时。
    1. 用于细菌检测时，我们使用 TRITC 标记的抗兔 Ig 抗体；用于 α-肌动蛋白及其他细胞骨架蛋白检测时，我们使用 FITC（Sigma）或 Alexa Fluor 488（Invitrogen）标记的抗小鼠 Ig 抗体。
  7. 孵育结束后，按步骤 4 和 5 的方法进行洗涤。
  8. 用含 0.6 μg/mL DAPI 的 PBS（DNA 染色剂）在室温避光条件下复染 5 分钟。
  9. 用 PBS 漂洗。
  10. 将载玻片（细胞面朝下）用一滴封片介质（例如 Mowiol 或 Vectashield）封固于载玻片上。
  11. 置于 4°C 避光保存。
  12. 样品可进行显微镜观察。

2. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）

为了观察和采集细胞内细菌及细胞骨架成分的图像，我们使用免疫标记的样品，并通过连接至Leica DM I6000倒置落射荧光显微镜的Leica SP5-AOBS共聚焦激光扫描显微镜采集图像。所有图像均采用63倍、数值孔径（NA）1.4的油浸物镜采集，并使用Leica软件进行处理。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）操作步骤：

  1. 开始共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）操作时，在物镜上滴加一滴浸油，并将样品载玻片盖玻片朝下放置于显微镜载物台上。
  2. 将显微镜设置为明场观察模式，通过显微镜目镜找到感兴趣的区域。
  3. 使用 Leica 软件，选择 xyz 采集模式。
  4. 选择 512 x 512 格式（帧大小）。对于共定位研究，分辨率越高，图像越准确，但需考虑显微镜的分辨率极限。然后选择双向 X 扫描模式，以提高扫描速度并减少光漂白。
  5. 设置逐层扫描参数。点击“seq”功能，并选择一种扫描模式。我们通常使用“线间扫描”模式。
  6. 根据与二抗偶联的荧光染料选择相应的激光束：DAPI（蓝色）使用 405 nm，Alexa Fluor 488（绿色）使用 488 nm，TRITC（红色）使用 561 nm。分别激活光电倍增管（PMT）1、2 和 3，并调节 PMT 设置以检测正确的发射波长。
  7. 设定 z 轴堆栈或序列的顶部（“起始”）和底部（“终止”）位置，然后设定所需的“z 轴步进大小”。
    1. Neisseria meningitidis 是一种双球菌（见图1G），由于每个球菌的直径约为 0.5 μm，因此选择 0.20 μm 的 z 轴步进大小，以提高每个球菌至少被扫描两次的概率。该步进大小也处于最佳分辨率范围（0.1 - 0.2 μm）之内。
  8. 通过设置 3 次线平均来确定最终扫描参数，以提高信噪比。
  9. 点击“开始”按钮，通过在不同波长下进行逐层扫描，获得双标或三标图像，从而消除不同发色团之间的串扰。
  10. 为评估两种荧光染料的共定位情况，选择“叠加”功能将选定通道合并为单张图像；例如，当 Alexa 488（绿色）和 TRITC（红色）荧光染料发生共定位时，叠加图像中将呈现黄色。
  11. 使用“最大投影”功能整合 z 轴堆栈或序列，生成用于观察可能共定位的二维图像。通过分析各个光学切片，可获得更详细的共定位信息。
  12. 在获取 z 轴堆栈或序列后，对数据进行处理，生成正交图像，以可视化不同组分在细胞内的定位（见图1E）。

3. 共定位的定量分析

使用 Volocity 软件（Improvision, PerkinElmer）对共聚焦扫描显微镜图像进行统计分析。该软件提供了一种专门用于共定位分析的工具，该方法由 Manders 描述。 等(1993)5在数字荧光成像中，共定位是指在同一通道的相同体素（像素体积）位置检测到信号。这两个通道由来自同一样本区域的两种不同荧光染料的图像组成（Volocity 用户指南）。使用 Volocity 软件（Improvision, PerkinElmer）进行统计分析，具体采用如下所述的定量共定位分析方法。

定量共定位分析

  1. 使用 Volocity 软件创建包含共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像的图像库。
  2. 在顶部工具栏中选择“扩展聚焦”（extended focus）功能。该工具将 z 轴层叠图像合成为一幅二维图像以供分析。
  3. 选择“共定位”（Colocalization）工具。待分析的两个通道应具有相同的颜色深度。
  4. 选择需要定量的区域，并设置阈值以去除背景信号。
  5. 通过选择“生成共定位”（generate colocalization）创建共定位输出结果。共定位统计结果将基于先前选定的兴趣区域生成。
  6. 选择 Manders 系数 R（重叠系数）和 My（共定位系数）。
    1. Manders 系数对染色强度不敏感，因其已对总像素强度进行了归一化处理；因此当一种抗原的染色强度明显强于另一种时，仍可使用该系数。
    2. 根据 Manders5,6定义的重叠系数 R 反映了真实的共定位程度，即共定位的像素数量占总像素数量的比例。
    3. 另一方面，共定位系数 My 描述了较丰富组分（本例中为 α-肌动蛋白，绿色）对较稀有组分（本例中为细菌，红色）的荧光贡献，即红色像素中与绿色像素重叠的部分占全部红色像素的比例。
    4. Manders 系数的取值范围为 1 至 0，其中 1 表示高度共定位，0 表示无共定位；但为便于解释，也可表示为百分比形式。
  7. 将统计数值导出至 Excel 文档，用于数据展示。

4. 代表性结果

表达 Opc 的细胞内定位 脑膜炎奈瑟菌 和α-肌动蛋白结合蛋白

对人脑微血管内皮细胞感染Nm 3小时和8小时后的共聚焦成像（如上所述）显示，α-肌动蛋白交联蛋白（α-actinin）与Nm存在共定位现象，该现象在感染3小时的实验中出现频率较低（未展示），而在感染8小时的培养物中更为明显（图1 A-F）。每次观察均发现α-actinin与表达Opc的脑膜炎奈瑟菌（meningococci）存在明显的共定位 >5 次重复实验。使用多张共聚焦图像对共定位进行的统计分析按上述方法进行。总体而言，在感染表达 Opc 的脑膜炎奈瑟菌的 HBMEC 中， >获得绿色（α-肌动蛋白）与红色（Nm）像素25%的重叠（图2B，重叠系数R）。与α-肌动蛋白不同，在对内化细菌以及肌动蛋白或波形蛋白进行标记的实验中，偶尔可观察到与肌动蛋白的共定位，而与波形蛋白的共定位则极为罕见（图2B）。

数据还通过系数 My 进行了分析，该系数考虑了每种组分的相对丰度。My 用于衡量每次丰度较低的信号（本例中为红色，细菌）出现时，丰度较高的信号（本例中为绿色，α-肌动蛋白）出现的频率。该指标显示，在内化脑膜炎奈瑟菌附近，α-肌动蛋白的出现频率显著升高（图 2A 和 C）。

共聚焦显微镜示意图，显示多色标记下的细胞结构和荧光标记物。
图1. 利用共聚焦激光扫描显微镜评估脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）与α-辅肌动蛋白的细胞内相互作用。 A-H. 在盖玻片上生长的融合内皮单层细胞被表达Opc的（A-F）N. meningitidis感染。感染8小时后，洗去未黏附的细菌，用多聚甲醛固定细胞，并用0.1% Triton X-100进行透化处理。随后，按照上述方法对细菌和α-辅肌动蛋白进行染色（α-辅肌动蛋白，绿色；细菌，红色）。

A-C。一个视野显示了Nm（A）或α-肌动蛋白（B）的x-y图像位置。（C）中的叠加图像显示了多处呈现黄橙色的区域，提示存在共定位现象。（A）和（B）中的箭头指示了细菌周围出现大量α-肌动蛋白聚集的区域。

D. 对感染的HBMEC单层细胞进行光学切片，显示在细胞基底部的胞内细菌周围存在共定位现象。

同样，这种共定位并非由于α-辅肌动蛋白的偶然接近所致，因为该区域α-辅肌动蛋白的整体染色水平较低。

E 和 F。按照上述方法处理的感染HBMEC单层细胞的三维图像。倾斜视角下的顶端表面（E）显示黏附的细菌呈红色（红色箭头），而位于内皮细胞基底面附近的一些细菌（黄色箭头）则明显呈橙色/黄色。在（F）的端面X-Z截面图中，细菌的基底位置可更清晰地观察到。

N. meningitidis 的负染色电子显微镜图像，显示其主要呈双球菌形态。每个球菌的直径约为 0.5 μm。

蛋白质定位显微镜；α-辅肌动蛋白、波形蛋白、肌动蛋白；重叠系数、相对表达水平。
图 2. α-辅肌动蛋白、肌动蛋白和波形蛋白在 HBMEC 细胞中的定位与分布。

A. 感染的HBMEC单层细胞经处理，处理方法如上文图注所述；除α-辅肌动蛋白外，部分盖玻片采用与α-辅肌动蛋白类似的方法用于检测肌动蛋白或波形蛋白。如上所示，α-辅肌动蛋白在多个被内化的细菌周围聚集（白色箭头）。波形蛋白和肌动蛋白未与细菌发生明显程度的共定位。标尺表示20 μm。

B. 和 C. 使用上述 Volocity 软件进行三次以上的实验，获得系数 R 和 My 的数值。

讨论

通过在感染后3小时和8小时，利用人脑微血管内皮细胞（HBMEC）检测细菌与细胞骨架蛋白α-肌动蛋白的共定位情况，探讨了内化表达Opc蛋白的脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）与α-肌动蛋白结合的可能性。共聚焦显微镜结果显示，脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）与α-肌动蛋白存在共定位现象。值得注意的是，尽管在3小时时细菌已被细胞内化，但此时与α-肌动蛋白的共定位信号较弱。细菌与细胞骨架蛋白的结合似乎需要更长的胞内滞留时间，因为在感染8小时后，大量细菌显示出与α-肌动蛋白明显密切的关联。α-肌动蛋白是一种多功能蛋白，细菌与该细胞骨架成分的相互作用可能对靶细胞功能产生重要影响，这正是当前研究的课题。

如上所述，共定位的定量分析需要精细的样品制备。应特别注意样品的固定、封闭时间以及抗体稀释度。为了获得最佳的信噪比，每种一抗和二抗都应在预实验中进行滴定，以确定最适浓度。根据我们的经验，使用Mowiol封片剂可获得更佳的成像效果。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由惠康信托基金（Wellcome Trust）和英国脑膜炎基金会（Meningitis UK）资助。HBMEC 细胞系由 K.S. Kim 博士提供。共聚焦成像和电子显微镜实验在布里斯托大学的沃尔夫森生物成像中心（Wolfson Bioimaging Facility）完成。我们还要感谢布里斯托大学的 Alan Leard 先生、Mark Jepson 博士以及 PerkinElmer 公司的 Alan Tilley 先生提供的帮助与建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 孔板康宁BC311
玻璃盖玻片VWR international631-0152
BHI 琼脂LAB MLAB048
M199Sigma-AldrichM2154
RPMI 1640Lonza Inc.BE12-167E
MEM非必需氨基酸Sigma-AldrichM7145
HANK’S 平衡盐溶液Sigma-AldrichH9269
FBSBioWhittakerDE14-801F
谷氨酰胺Sigma-AldrichG7513
丙酮酸钠Sigma-AldrichS8636
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP0781
MEM维生素溶液Sigma-AldrichM6895
PBSBLonza Inc.BE17-513F
BSASigma-AldrichA9418
多聚甲醛Fisher ScientificP/0840/53
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
DAPISigma-AldrichD-9564
VectashieldVector LaboratoriesH-1000
Mowiol 4-88Calbiochem475904
抗‑Nm 抗血清实验室培育兔血清
TRITC 抗兔 IgSigma-AldrichT6778
抗 α‑α-肌动蛋白单克隆抗体 [7H6]AbcamAb32816IgG
抗肌动蛋白单克隆抗体Sigma-AldrichA4700IgG2a
抗波形蛋白单克隆抗体Sigma-AldrichV6630IgG1
ALEXA FLUOR 488 抗‑小鼠 IgGInvitrogenA11001
FITC 标记的抗小鼠 IgGSigma-AldrichF-2012

1. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）：

Leica SP5 共聚焦成像系统：该系统通过结合使用声光可调滤光器（AOTF）和声光分光器（AOBS），简化了特定波长的激发光选择。

2-软件：

Leica 共聚焦软件 LCS，Leica Microsystems，德国
Volocity 5，Improvision，PerkinElmer，美国

参考文献

  1. Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions. Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).
  2. Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides. Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).
  3. Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin. Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).
  4. Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells. Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).
  5. Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images. Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).
  6. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).

重印与许可

标签

α-辅肌动蛋白共定位分析人血管内皮细胞细菌内化免疫荧光染色细胞骨架蛋白相互作用Volocity 软件Mander 系数
Neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。