细胞外多糖的寡糖质谱分析（OLIMP）

摘要

本文描述了一种快速了解细胞外基质中多糖结构的方法。该方法利用了糖基水解酶的特异性和质谱技术的高灵敏度，可分析极微量的样品。此技术可直接应用于组织本身。

摘要

在许多生物体中，细胞与环境之间的直接接触由细胞外基质介导。细胞外基质的一个共同特征是含有以糖蛋白、蛋白聚糖和/或多糖形式存在的复杂糖类结构。例如，人类和动物细胞的细胞外基质主要由纤维状蛋白和蛋白聚糖组成，植物和真菌的细胞壁以多糖为主，而细菌的细胞壁则基于蛋白聚糖和糖脂。所有这些糖结构在细胞间以及细胞与环境之间的通讯和信号传导中发挥着至关重要的作用。

高等植物细胞壁中存在着一种极为复杂的细胞外基质实例。植物细胞壁几乎完全由糖类构成，占干重的75%之多，包含地球上最丰富的生物聚合物。因此，研究人员致力于探索如何将这些材料作为碳中性的可再生资源加以充分利用，以替代源自化石燃料的石化产品。目前燃料转化面临的主要挑战在于，由于这种独特的生物复合材料中存在特有的糖结构，导致其细胞壁对酶解或化学降解具有较强的抗性。

本文介绍一种用于快速、灵敏分析植物细胞壁糖结构的方法。该方法称为寡糖质谱分析法（OLIMP），基于特异性糖基水解酶从细胞壁材料中酶促释放寡糖，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）¹（图1）对溶解后的寡糖混合物进行后续分析。OLIMP 完整分析仅需约 5000 个细胞的细胞壁材料，可直接在组织样本上进行²，并适用于高通量分析³。尽管 OLIMP 无法测定溶解寡糖的绝对含量，但可通过质谱图中不同寡糖离子的相对丰度，揭示细胞壁中天然多糖的取代模式。

OLIMP可用于分析多种细胞壁多糖，其应用范围仅受限于特异性酶的可获得性⁴例如，可利用木葡聚糖酶分析存在于植物细胞壁中的半纤维素木葡聚糖^{5, 11, 12, 13}，使用木聚糖 内皮-β-(1-4)-木聚糖酶 ^6,7，或使用多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲酯酶的组合来处理果胶多糖 ⁸此外，利用相同的原理，OLIMP 还可用于监测和测定糖基水解酶甚至糖基转移酶的活性。 ⁹.

方案

本实验以双子叶植物细胞壁中主要的半纤维素——木葡聚糖为例，采用内切葡聚糖酶作为糖基水解酶，展示了OLIMP方法的应用。实验以完整的拟南芥（Arabidopsis）幼苗作为植物组织来源。根据所需的分析目标，可替换不同的酶和细胞外基质材料，但操作流程保持不变。

1. 细胞壁的分离

1. 收获五株5天大的完整Arabidopsis幼苗，或等量的所需材料，转移至1.5 mL离心管中。确保材料位于管底。
2. 在样品上方加入两颗3 mm金属珠，随后在液氮中迅速冷冻。
3. 使用球磨仪研磨冷冻样品（2分30秒，25 Hz）。
4. 向样品中加入1 mL 70%乙醇水溶液。用磁铁移除金属珠，充分涡旋振荡。
5. 以14,000 rpm离心10分钟，使含有细胞壁材料的醇不溶性残渣沉淀。
6. 小心抽吸去除上清液，注意不要扰动沉淀。
7. 加入1 mL氯仿/甲醇（1:1 v/v）溶液，充分涡旋振荡以重新悬浮沉淀。
8. 以14,000 rpm离心10分钟，小心抽吸去除上清液，注意不要扰动沉淀。
9. 使用浓缩仪将样品干燥。

2. 寡糖的溶解

1. 为了将特定多糖以其寡糖形式溶解，将干燥的沉淀重悬于25μl适当的缓冲液中。对于内切葡聚糖酶，使用50mM甲酸铵缓冲液（pH 4.5）。加入0.2U内切葡聚糖酶。涡旋混匀后离心收集液体。
2. 将样品在37°C孵育器中孵育16小时，以300rpm振荡。
3. 使用浓缩仪除去消化产物中的溶剂（水）。

3. 释放的寡糖的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

1. 使用 BioRex MSZ 501 阳离子交换树脂珠去除消化后样品中的盐分和酶。将适量树脂珠装入空柱中，并用大量水洗涤树脂珠以进行预处理。
2. 向已消化并干燥的样品中加入 5–10 个 BioRex 树脂珠。然后加入 10 μl 水；若样品量较少，可使用 5 μl 水。短暂离心试管使树脂珠浸入溶液中。室温孵育至少 10 分钟。
3. 取 2 μl 基质溶液（2,5-二羟基苯甲酸（DHB），10 mg/ml 溶于水）点样至 MALDI 目标板上。在真空条件下蒸发基质溶剂，形成均匀的基质化学晶体。
4. 将 2 μl 脱盐后的样品溶液点加在目标板上的基质晶体表面。
   
   若需点样大量样品，每次点样操作时间不应超过 3 分钟。此时间范围可确保最先点样的样品尚未完全干燥。所有样品点样完毕后，额外等待 2 分钟，以确保最后点样的样品中重新溶解的基质与寡糖分子充分混合。随后将目标板置于真空下干燥。
   
   样品与基质的混合物应在 1 分钟内结晶，以实现均匀结晶。
5. 将目标板放入 MALDI-TOF 质谱仪中。仪器应设置为正离子反射模式，加速电压为 20000 V，延迟时间为 350 nm；选择的质量范围应为 500–3000 Da（可根据预期的寡聚物适当调整）。启动激光，每样品采集 100–200 张谱图，并合并生成一张代表性的平均谱图（图 2A）。可通过质荷比（m/z）鉴定代表特定寡糖的离子。将所有目标离子的离子强度（峰高）加总至 100%，从而得出各样品中每种寡糖的相对丰度（图 2B）。

4. 原位 OLIMP分析

OLIMP 也可直接用于组织，无需进行任何细胞壁制备步骤。以去黄化的拟南芥（Arabidopsis）下胚轴作为植物组织来源为例，同样使用内切葡聚糖酶来分析半纤维素木葡聚糖的结构。根据所需的分析内容，可采用相同实验流程替换相应的酶和组织材料。

1. 采集一株黄化幼苗，将其放置于空的MALDI靶板上，并让幼苗自然干燥。
2. 在干燥后的幼苗指定位置加入0.5μl内切葡聚糖酶（0.4U/μl，溶于50mM甲酸铵缓冲液，pH 4.5）。确保酶液滴部分接触靶板表面。
3. 将MALDI靶板置于密闭容器中，容器内保持饱和湿度，以防止酶液滴干燥。在37°C条件下孵育16小时。
4. 在真空条件下干燥含有植物组织和酶液滴的MALDI靶板。
5. 在每个干燥的酶反应位点上加入0.5μl基质（DHB；10mg/l），静置2分钟。
6. 再次在真空条件下干燥MALDI靶板。
7. 使用MALDI-TOF质谱仪进行样品分析。将含有植物组织及酶/基质反应点的靶板放入MALDI-TOF质谱仪中。仪器参数应设置为正离子反射模式，加速电压为20000V，延迟时间为350 nm；质荷比扫描范围应设为500–3000 Da（可根据预期寡糖片段大小进行调整）。
8. 开始用激光照射基质/样品结晶区域中紧邻组织的位置。务必避免直接照射组织本身，否则会导致分子飞行时间偏移。每个位点采集约20–50张谱图，并合并生成一张代表性平均谱图（图3）。通过质荷比（m/z）识别代表特定寡糖的离子信号。可报告离子强度（峰高），并将所有目标离子信号归一化至100%，以获得各样品中各寡糖的相对丰度。

5. 代表性结果

图2展示了拟南芥（Arabidopsis）幼苗中半纤维素木葡聚糖的OLIMP分析示例。由于离子之间的质量差异以及已知且特征明确的酶（内切葡聚糖酶）的特异性，可将各离子指认为特定的寡糖结构（图2A）。显然，该方法无法区分结构异构体。确定各种寡糖相对丰度（图2B）的基本假设是，这些寡糖在质谱中的响应因子非常相似。如本图所示，OLIMP定量具有高度可重复性。但需注意，该方法的稳健性在很大程度上依赖于各种寡糖离子的信噪比。例如，盐类污染或寡糖含量较低均可能降低该比值。

组织原位的OLIMP分析能够研究非常微小且特定的区域，并且所需样品制备极少。在本示例中（图3），茎与根组织之间未观察到定性差异（离子种类相同），但存在定量差异（离子强度的变化） 拟南芥 幼苗。因此，OLIMP方法的多种变化可实现组织“成像”。

图1. OLIMP 方法流程图（使用完整样本） 拟南芥 以幼苗作为植物来源。首先，将组织进行研磨并制备细胞壁材料（图片改编自 Fujino 等人）。¹⁰然后使用特异性水解酶释放细胞壁多糖的寡糖片段。最后，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定可溶性寡糖的相对丰度。

图2. 黄化幼苗中木葡聚糖寡糖的相对丰度 拟南芥 由OLIMP测定。A）代表性木葡聚糖寡糖质谱图；每个离子代表一种特定的寡糖结构，无法区分结构异构体。B）用于确定寡糖相对丰度的相应柱状图。

图3. 原位 使用黄化幼苗进行OLIMP分析 拟南芥 例如，每个酶/消化液滴（彩色圆圈）均可独立分析，并可获得和分析相应的质谱图。

图4. 采用木聚糖酶（Megazyme）消化芒草叶片材料后，通过OLIMP方法获得的半纤维素木聚糖的质谱图。

讨论

本文介绍的 OLIMP 方法能够对细胞外基质中存在的多聚物进行高灵敏度且快速的分析。OLIMP 方法结合了酶解释放寡聚物与后续的 MALDI-TOF 分析。生成一张 MALDI-TOF 谱图耗时不到一分钟，因此 OLIMP 适用于多种应用，包括高通量研究，如突变体筛选。OLIMP 不仅限于植物多糖，理论上可应用于多种多聚物，其应用范围仅受限于特异性水解酶的可获得性。然而，OLIMP 的一个局限性在于无法获得多聚物的绝对丰度。

如前所述，OLIMP 可用于研究多种物种细胞外基质中多种多糖的结构。例如，图 4 展示了禾本科植物中主要半纤维素——木聚糖的 OLIMP 谱图。在此实验中，来源于温带禾草芒属（Miscanthus）的细胞壁材料经木聚糖酶消化处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,5-二羟基苯甲酸	Sigma-Aldrich	37550	10mg/mL 水溶液
BioRex MSZ 501(D) 树脂	Bio-Rad	142-7425
内切葡聚糖酶	Megazyme	E-CELTR
木聚糖酶 M6	Megazyme	E-XYRU6
3mm 金属球	Retsch	22.455.0011
球磨机	Retsch	Mixer Mill MM400
MALDI-TOF	Shimadzu Corporation	Axima Performance
MALDI 目标靶板	Kratos Analytical	DE4555TA
SpeedVac	Eppendorf	Vacufuge 5301
真空抽滤装置	EMD Millipore	MSVMHTS00
真空泵	Welch Allyn	DryFast Ultra 2032