本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。
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摘要
摘要
在多种细胞外配体的刺激下，STAT（信号转导子和转录激活子）转录因子会迅速从细胞质中的静息状态被招募至细胞表面受体，并在单个酪氨酸残基上发生磷酸化而被激活1。随后，它们形成二聚体并转入细胞核，驱动靶基因的转录，从而影响细胞生长、分化、稳态及免疫应答。鉴于STAT因子广泛参与正常的细胞生理过程，其功能失调与人类疾病密切相关，尤其是癌症2和自身免疫性疾病3。
已有充分证据表明，转录过程受到染色质模板改变的调控4,5。这些改变包括ATP依赖性复合物的活性，以及组蛋白的共价修饰和DNA甲基化6。由于STAT激活基因表达具有快速且短暂的特点，因此需要特定的机制来调控依赖STAT的基因位点上的染色质模板。为了明确这些机制，我们对响应STAT信号通路的基因位点上的组蛋白修饰及其产生这些修饰的酶活性进行表征。本实验方案描述了染色质免疫沉淀技术，该方法在研究STAT信号通路对活化基因表达中染色质的调控方面具有重要价值。
方案
规划
计划进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验的前一天，应培养细胞以确保获得足够数量的细胞。假设每次ChIP检测需要约1-1.5 × 107个细胞。务必同时设置阴性对照（IgG）和阳性对照（pan组蛋白抗体），并进行重复实验。
提示 - 对于2FTGH细胞，每次ChIP检测大约需要一个直径15 cm、汇合度为80%的组织培养皿。
第一部分：制备染色质并进行染色质免疫沉淀（ChIP）
- 移除培养基，并用含有5 ng/mL IFN-γ的20 mL 10% 天然小牛血清（CCS）/DMEM培养基诱导细胞，诱导时间按实验要求进行。同时，将未诱导组培养板中的培养基更换为20 mL 10% CCS/DMEM。
- 在通风橱中，加入 540 μL 将37%甲醛加入15 cm培养皿的培养基中，至终浓度为1%（总体积20 mL）。
提示 - 倾斜培养板，将甲醛加入培养基液滴中，然后轻轻摇动培养板使其均匀分布。 - 室温下孵育10分钟以完成交联反应。
- 加入甘氨酸至终浓度为 0.125 M，以终止交联反应。
- 吸除培养基，用10 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
- 用细胞刮在约 7 mL PBS 中收集细胞，并将来自 6 个培养板的经相同处理的细胞合并至一个 50 mL 离心管中，置于冰上。
- 离心机（Beckman Coulter Allegra 12-R Centrifuge）在1800 rpm下离心 4°C 5 分钟后吸除 PBS。
提示 - 若在此处停止操作，需将细胞沉淀速冻，并于 -80°C. - 将细胞沉淀重悬于4 mL裂解缓冲液（25 mM HEPES pH 7.8, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 1 mM DTT, 1×蛋白酶抑制剂）中。2，10 mM KCl，0.1% NP40。使用前加入1 mM DTT和Complete蛋白酶抑制剂，冰上预冷，转移至15 mL锥形管中。
提示 - 此裂解缓冲液体积适用于6孔板合并处理（约6-9 × 107 细胞）。缓冲液体积过多或过少都可能影响玻璃匀浆器的破碎效率。 - 将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。
- 将悬液转移至预冷的15 mL Dounce匀浆器（Wheaton）中，用A型研杵匀浆20次。
- 将经Dounce匀浆器处理的细胞转移回冰上的15 mL锥形管中。
- 2500 rpm 离心 5 分钟，温度为 4°C 弃去上清液。
- 重悬细胞核沉淀（约 200 μL 来自6个培养板）加入3 mL（15倍沉淀体积）超声缓冲液（50 mM HEPES pH 7.9，140 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，0.1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS。使用前冰上预冷，并加入Complete蛋白酶抑制剂）。
提示 - 此超声缓冲液体积适用于6孔板合并处理（约6-9 x 107 细胞）。缓冲液体积过多或过少都可能影响超声处理效率。 - 将细胞核悬液置于冰上，使用配备微探头的Misonix Sonicator 3000进行超声处理，共10个循环（每个循环20秒开启/40秒关闭，振幅设为8）。此过程通常可获得平均大小为200-1000 bp的染色质片段。
提示 - 由于不同超声破碎仪的性能存在差异，超声破碎效率必须通过实验经验确定。为此，取等分试样 20 μL 超声处理前及每个超声处理循环后。将这些样品加热 65°C 孵育4小时。加入DNA上样缓冲液，用标准的1%琼脂糖/TBE凝胶电泳检测DNA片段。
- 将超声处理后的样品转移至SS34离心管中，以20分钟离心 4°C 在SS34转子（Sorvall RC6 Plus离心机）中以13000 rpm离心，以沉淀通常为少量的细胞碎片。
- 将上清液小心转移至预冷的15 mL锥形管中，置于冰上。
- 预清除：通过添加 360 μL 鲑鱼精子DNA/蛋白A或G琼脂糖凝胶珠悬液及振荡处理 4°C 至少 30 分钟。
提示 - 此步骤可降低由非特异性结合事件引起的检测背景噪声。 - 以1000 rpm离心 4°C 5 分钟以沉淀琼脂糖珠。
- 将预清除的上清液转移至另一支预冷的15 mL离心管中，置于冰上。
- 测定预清除染色质的 A260 单位，并用超声缓冲液调整体积至 4 个 A260 单位（假设 1 个 A260 单位 = 0.050 mg/mL，则相当于 0.2 mg/mL）
提示 - 为测定A260单位，需稀释 10 μL 预清除染色质的 190 μL 去离子水；空白分光光度计用 10 μL 超声缓冲液中 190 μL 去离子水
- 保存 75 μL 染色质（以4 A260单位计）作为输入样本并保存于 20°C 直至准备进行交联逆转。
提示 - 此步骤对于数据分析至关重要，切勿忽略取样输入等分试样。 - 将制备好的染色质在冰上分装至1.7 mL离心管中，每管1 mL。
提示 - 如果在此停止，将制备好的染色质在干冰上速冻，并于 -80°C 保存80°C注意：储存的染色质可能发生降解，导致结果不理想，因此应尽量避免使用。 - 将ChIP级抗体分别加入诱导和未诱导的样本组中，每组设两个重复。加入IgG（2 μg）以及全组蛋白 H3 抗体（15 μL作为诱导和未诱导样本组的阴性对照和阳性对照。
提示 - 抗体的使用量必须通过实验确定，或参考供应商提供的产品说明书中的建议用量。通常为1-2 μg 使用一种经染色质免疫沉淀（ChIP）验证的抗体效果良好。对于以血清形式提供的抗体，其合适用量必须通过实验确定。
- 将所有试管在摇床上过夜震荡 4°C.
第二部分：收集免疫复合物
- 向所有试管中加入 60 μL 鲑鱼精子 DNA/Protein A 或 Protein G 琼脂糖珠悬液。
提示：兔多克隆抗体使用 Protein A，鼠单克隆抗体使用 Protein G。 - 在 4°C 条件下振荡孵育至少 60 分钟。
- 在 4°C 下以 2000 rpm 轻柔离心 3 分钟，沉淀免疫复合物（琼脂糖珠）。
- 吸除上清液。
- 依次用下列每种洗涤缓冲液在 4°C 振荡洗涤 10 分钟。每次洗涤后在 4°C 以 2000 rpm 离心 3 分钟，吸除上清液。样品始终保持在冰上。使用前立即加入 PMSF。
- 低盐洗涤液 - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- 高盐洗涤液 - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
- LiCl 洗涤液 - 0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF
- TE 洗涤液 - 用 TE 缓冲液洗涤两次 - 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
- 去除最后一次 TE 缓冲液洗涤液，向琼脂糖珠中加入 500 μL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS）。
提示 - 洗脱缓冲液应新鲜配制。
- 涡旋混匀琼脂糖珠与洗脱缓冲液，于 65°C 加热 30 分钟。
提示 - 在此 30 分钟期间，每 10 分钟至少涡旋一次各管。 - 以 2000 rpm 离心 30 秒，将洗脱液转移至新的微量离心管中。
提示 - 洗脱过程中，将输入样品解冻，并向每个样品中加入 500 μL 洗脱缓冲液。后续所有步骤均需包含这些样品。
- 向所有样品中加入 5 M NaCl，使其终浓度为 200 mM，并涡旋混匀。
- 在 65°C 孵育过夜（或至少 4 小时）。
第3部分：纯化染色质免疫沉淀的DNA和输入DNA
- 将所有样品在微量离心机中离心30秒，以收集管盖上的冷凝液。
- 向每管中加入1μL RNase A（10 U/μL），室温孵育15分钟。
- 加入10 μL 0.5 M EDTA、40 μL 0.5 M Tris-Cl（pH 6.5）、2 μL 蛋白酶K（10 mg/mL），并在45°C孵育60分钟。提示：可将上述试剂配制成主混合液，每管加入52 μL。
- 用酚/氯仿/异戊醇抽提样品，随后再用氯仿/异戊醇抽提一次。
- 加入2 μL糖原（25 μg/μL）和0.1倍体积的3M乙酸钠（pH 5.2），涡旋混匀。
- 加入2.5倍体积的100%乙醇，涡旋混匀。
- 在20°C孵育过夜。
第4部分：继续纯化染色质免疫沉淀DNA和输入DNA
- 在 4°C 条件下，以 13000 rpm 离心样品至少 20 分钟，以沉淀 DNA/糖原沉淀物。
- 用 1 mL 70% 乙醇洗涤 DNA/糖原沉淀物。
- 将沉淀物空气干燥，或使用 DNA Savant 快速真空离心浓缩仪快速干燥。
提示 - 切勿过度干燥 DNA。 - 将 DNA/糖原沉淀物重悬于 200 μL TE 缓冲液中。
- DNA（1 μL）可用于实时 PCR 定量。剩余 DNA 储存于 20°C。
提示 - 使用超过 1 μL 的 DNA 可能会抑制实时 PCR 反应，因此请谨慎增加用量。
第5部分：代表性结果：
使用针对目标基因位点的特异性引物，通过实时PCR7,8（Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System）对ChIP和Input DNA样本进行定量。同时，可选用针对已知在所检测的组蛋白修饰中富集或缺失的基因组序列的引物作为阳性和阴性对照。数据以Input百分比（Percent of Input）表示。为确保所报告的组蛋白修饰变化具有统计学显著性，ChIP实验应完全重复三次生物学重复。
使用实时 PCR 定量 DNA 时，需考虑若干重要问题，包括引物设计、PCR 扩增效率，以及计算输入百分比和归一化处理的适当方法。在分析基因上组蛋白修饰占据情况时，所有引物对之间的 PCR 扩增效率必须保持一致。实时 PCR 系统的制造商可提供必要的信息和培训。
图1显示了由干扰素-γ（IFN-γ）触发的STAT1激活IRF1基因过程中染色质免疫沉淀的代表性结果9。
图1. STAT1 激活 IRF1 基因过程中，STAT1、RNA 聚合酶 II 和 H3K36me3 的占据呈动态变化。（A, B, C） 对经干扰素-γ（IFN-γ）诱导30分钟（红色方块）、1.5小时（蓝色圆圈）、5小时（绿色三角形）或未诱导（黑色菱形）的2FTGH细胞提取的染色质进行ChIP实验，使用抗H3K36me3（α-H3K36me3）、抗STAT1（α-STAT1）和抗Pol II（α-Pol II）抗体。IgG为阴性对照（灰色十字）。（D） Pan H3为阳性对照，显示在诱导（蓝色圆圈）和未诱导（黑色菱形）条件下该基因座的组蛋白占据情况。-5 bp附近的信号下降是由于转录起始位点处常见的核小体耗竭所致。
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讨论
本实验方案中所述的染色质免疫沉淀（ChIP）方法已在实验室成功用于检测二十多种不同的组蛋白修饰。此外，我们还利用该方法表征了在多种干扰素-γ（IFN-γ）诱导基因上，转录因子、组蛋白修饰酶、识别组蛋白修饰的蛋白质以及RNA聚合酶II转录机器的占据情况变化。我们还应用该流程分析了癌症干细胞分化过程中组蛋白修饰的动态变化10。
ChIP 数据的质量最终取决于所用抗体的有效性，而不同抗体之间的效果存在较大差异。因此，未能通过 ChIP 检测到某种修饰，并不能解释为该修饰不存在。此外，在 ChIP 实验中观察到的某种特定修饰的变化，可能仅仅反映了由于邻近残基上其他组蛋白修饰的存在，导致抗体对表位识别能力的改变。因此，必须通过能够将组蛋白修饰的观察变化与生物学结果相关联的方法来验证 ChIP 结果。当做到这一点时，ChIP 就成为研究染色质相关机制如何参与基因表达调控的一种强有力手段。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由弗吉尼亚大学、弗吉尼亚大学癌症中心以及托马斯·F·和凯特·米勒·杰弗里斯纪念信托基金资助。我们感谢洛克菲勒大学詹姆斯·E·达内尔实验室和福特汉姆大学罗伯特·罗斯实验室提供的细胞系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 37% 甲醛 | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| 氯仿/异戊醇 | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini 蛋白酶抑制剂 | Roche Group | 1836153 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| 乙醇 | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| 甘氨酸 | Roche Group | 100149 | |
| 糖原 | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 醋酸钠 | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 脱氧胆酸钠盐 | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| 抗组蛋白 H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| 苯酚/氯仿/异戊醇 | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| 蛋白酶 K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNase A | 5 PRIME | 2500130 | |
| 鲑精 DNA/Protein A 琼脂糖 | EMD Millipore | 16-157 | |
| 鲑精 DNA/Protein G 琼脂糖 | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| 抗-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| 抗-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| 抗-RNA 聚合酶 II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
参考文献
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
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