青鳉胚胎去壳及用于嵌合体制备的细胞移植 关键词：青鳉，胚胎去壳，细胞移植，嵌合体，发育生物学，模式生物

摘要

由于青鳉胚胎具有坚硬的卵壳和柔软的胚胎组织，其操作比斑马鱼更为复杂。本视频逐步展示了青鳉胚胎操作的各项技术，包括脱膜处理、琼脂糖包埋用于成像以及细胞移植以制备嵌合体。这些技术对于在实验室中充分利用青鳉与斑马鱼在脊椎动物基因组功能遗传解析方面的互补优势至关重要。

摘要

青鳉是一种小型卵生淡水鱼类，可同时进行遗传学和胚胎学分析，是三种开展过全基因组表型驱动突变体筛选的脊椎动物模式生物之一¹。青鳉与斑马鱼在相关基因功能重叠方面的差异使得能够鉴定出在单一物种中无法识别的新表型²，因此青鳉与斑马鱼在解析脊椎动物基因组功能方面具有互补性。在实验室中对青鳉胚胎进行操作，例如去壳、为成像而固定胚胎以及细胞移植，是同时研究青鳉和斑马鱼的关键步骤。细胞移植可用于检验青鳉突变的细胞自主性。通过将标记的供体胚胎细胞移植到未标记的受体胚胎中，可产生嵌合体。根据命运图谱³，可将供体细胞移植至受体胚胎的特定区域，从而使移植细胞的克隆在发育过程中整合到目标组织中。由于青鳉胚胎具有坚硬的卵膜和柔软的胚胎本体，其操作难度较斑马鱼更高。在本视频中，我们将展示操作青鳉胚胎的详细步骤。

方案

1. 胚胎的发育

1. 卵子产出时由于卵壳上的附着丝而聚集成团。为了使胚胎正常发育，需要将卵子分离。用两把镊子夹住附着丝，将其缠绕并剪断，以实现分离。
2. 分散后，将卵子与粪便和藻类分离，并转移至新鲜的胚胎培养液中，每6 cm培养皿中最多放置40枚卵。
3. 在27°C条件下，青鳉胚胎的发育速度略慢于斑马鱼。两种物种的孵化时间不同：青鳉胚胎在7天后从卵壳中孵出，并立即开始游动和摄食；而斑马鱼胚胎在2天后孵出，但需5–6天才开始游动和摄食。青鳉的发育分期依据岩松分期标准⁴。
4. 通过选择适宜的温度，可方便地调节青鳉胚胎的发育进程以适应实验安排。在早期发育阶段，可将胚胎置于4°C环境中使其发育暂停。在第24期之后（心脏开始跳动后），可将最低温度设为18°C以减缓发育速度。
5. 与斑马鱼相比，青鳉器官/组织出现的时间略有差异；例如，在青鳉中，体节形成发生在脑发育启动之后，而在斑马鱼中，体节形成早于脑发育。

2. 去除绒毛膜

青鳉的卵膜由两层保护结构组成，内层较硬，外层较软。因此，需要采用蛋白酶分两步处理，即先用蛋白酶K（pronase），再用孵化酶，以去除该卵膜。

去壳后，胚胎应保存在1X BSS中。半无菌条件有助于提高去壳胚胎培养的成功率，尤其是在需要较长时间观察时。这些条件包括使用无菌溶液（例如，添加抗生素的灭菌1X BSS）以及用70%乙醇灭菌后以1X BSS冲洗的无菌工具。

由于去壳的青鳉胚胎比去壳的斑马鱼胚胎更柔软且更脆弱，因此必须格外小心，确保胚胎不接触空气或移液管中的气泡，否则会导致胚胎立即塌陷。为尽量减少对胚胎的损伤，转移胚胎时应使用宽口经热抛光的玻璃移液管配合移液器泵，观察时可用毛细环调整胚胎方向。应使用防吸附的培养皿，以防止胚胎附着于器皿表面。

1. 去壳前应检查卵是否已充分分离和清洁。
2. 由于蛋白酶和孵化酶均为蛋白酶类，应将其置于冰上保存，并尽量减少胚胎暴露于这些酶的时间。
3. 将卵转移至置于9 cm培养皿盖内的砂纸（P2000粒度，防水）上。去除多余培养基，但需保留足够体积以防止胚胎干燥。
4. 轻轻滚动胚胎约45–60秒，以去除部分外层绒毛并轻微划伤卵壳表面（图1）。将胚胎转移回原培养皿中进行观察。
   
   在砂纸上滚动胚胎时，使用食指，施加最小压力，并保持手指与砂纸表面平行。每次滚动不超过5–7个胚胎。此预防措施可最大限度降低胚胎相互挤压而破裂的风险。
   
   
5. 用20 mg/ml蛋白酶替换培养皿中的卵培养基，并在27°C下孵育胚胎40–60分钟。
   
   确保胚胎被蛋白酶充分覆盖，且培养皿加盖。此步骤期间未使用的蛋白酶应置于冰上，以减少自降解，可重复使用直至活性丧失（约1–2周）。
   
   
6. 回收蛋白酶以供再用，并用胚胎培养基洗涤胚胎5次，以去除残留的蛋白酶，否则会影响后续添加的孵化酶活性。
7. 去除胚胎培养基，加入孵化酶覆盖胚胎，确保胚胎在培养皿中呈单层分布。
   
   若卵在培养皿中堆叠，底层的胚胎将在卵壳溶解过程中被压碎。未使用的孵化酶应保持在冰上。
   
   
8. 在27°C下孵育胚胎，15分钟后开始定期使用体视显微镜检查孵化进展。
   
   可观察到卵壳内层开始出现多个类似月球陨石坑的小孔，随后内层迅速溶解，仅剩柔软的外层，可手动轻易去除。整个孵化过程可能需要15–60分钟。
   
   
9. 一旦胚胎从卵壳中脱出，立即将其转移至含有1X BSS的培养皿中。
   
   转移时避免将孵化酶带入1X BSS中，可将移液器尖端轻触BSS液面，使胚胎缓慢滚出。
   
   
10. 当所有胚胎均从孵化酶中转移后，再进行一次最终转移至另一新鲜的1X BSS培养皿中。
    
    此步骤可确保胚胎不再接触任何残留的孵化酶，以免损伤暴露的胚胎。在最终培养皿中，仍保留卵壳外层的胚胎可在体视显微镜下使用灭菌的显微镊子手动分离。
    
    若去壳后需继续培养胚胎，应在BSS中添加青霉素/链霉素以防止细菌生长。
    
    

图 1. 脱膜过程中卷曲与未卷曲胚胎的比较。注意观察 B 面板中卷曲的胚胎缺少 A 面板未卷曲胚胎所具有的毛状结构。

3. 固定去壳胚胎

琼脂糖包埋适用于活体胚胎的长时间成像（例如延时成像），也适用于固定胚胎的详细观察。在原肠胚形成期及早期器官发生期（第14至第28期），青鳉胚胎的表层组织（覆盖发育中胚胎和卵黄的一层组织）会表现出节律性的收缩运动波⁵。通过使用3.5 mM 1-庚醇处理胚胎，可抑制其收缩运动⁶。

为防止28期（64小时）后胚胎移动，可在包埋前滴加甲基氨基苯甲酸乙酯（TMS）对胚胎进行麻醉。同时将TMS加入琼脂糖中（仅需加入极少量，该浓度需优化，约为1:25稀释）。

1. 将少量3%低凝胶温度琼脂糖（溶于1× BSS中）加热至37°C使其解冻，并在此温度下保持。
2. 以下步骤需迅速操作，以确保在胚胎定位完成前琼脂糖不会凝固。使用宽口玻璃移液管转移足量熔融琼脂糖至Eppendorf管盖的凹槽内。
3. 将一个去壳胚胎转移至管盖凹槽中，尽量减少随胚胎带入的BSS液体。立即从凹槽中吸取琼脂糖和胚胎，并转移至培养皿成像室。
   
   使用底部带有玻璃窗口的3.5 cm培养皿。若使用倒置显微镜成像，应将胚胎腹面朝下定位，并紧贴盖玻片放置；若使用正置显微镜成像，则应尽量减少琼脂糖的厚度。
   
   
4. 将3.5 cm培养皿放入盛有冰水混合物的大培养皿中（14 cm直径，加水至约其总深度的1/3）。在将成像室牢牢压在14 cm培养皿底部的同时，用毛细环在熔融琼脂糖中轻柔地调整胚胎至所需方向，并通过轻微上下移动小培养皿至其在冰水中的原始位置，保持胚胎位置直至琼脂糖凝固。

4. 青鳉胚胎中的细胞移植

本实验的目的是确定目标基因是细胞自主性发挥作用（在细胞内）还是非细胞自主性发挥作用（细胞之间）。

移植前可使用示踪染料（如罗丹明-葡聚糖）对供体细胞进行标记（具体步骤见配套的 JoVE 方案《青鳉胚胎显微注射》），或采用表达 GFP 的转基因品系，以便于移植后的评估。结合使用这两种标记技术通常有助于克服可能出现的自发荧光问题。对于移植后的时间序列研究，GFP 表达尤为有用。

在整个操作过程中使用带移液球的宽口玻璃移液管，并在操作前用70%乙醇对所有工具（包括载玻片）进行消毒，随后用无菌1×BSS彻底冲洗。受体胚胎通常发育至约12期，此时便于在进行移植操作时区分腹侧和背侧极性。

1. 在移植前1.5小时开始去除胚胎的卵膜，并在酶孵育期间准备显微注射装置。
2. 将一个凹面载玻片放入直径为9 cm的培养皿中。
3. 使用无菌移液枪头吸取少量3%甲基纤维素，滴加至凹面载玻片中央，并均匀薄层涂布。
4. 将甲基纤维素干燥约1-2分钟。
5. 加入350μl无菌1X BSS，使凹面完全浸没。
6. 使用玻璃移液管将一个供体胚胎和最多四个受体胚胎转移至载玻片上。
7. 使用毛发环调整胚胎方向，使胚胎的胚盘朝上。
   
   可将胚胎相互倚靠以进一步提高稳定性。
   
   
8. 将显微注射针轻轻插入供体胚胎的胚盘，缓慢吸取10-20个细胞。
9. 将注射针轻轻插入受体胚胎胚盘的相应区域，缓慢释放细胞。插入细胞时需格外小心，避免破坏细胞与卵黄囊之间的边界，否则将导致胚胎死亡。
10. 将无菌1X BSS倒入培养皿中。
    
    倒入BSS时应尽量靠近培养皿侧壁，避免扰动胚胎。切勿将BSS直接倾倒在胚胎上，并加入足量BSS以完全浸没载玻片和胚胎。
    
    
11. 向培养皿中加入100μl青霉素/链霉素，盖上皿盖。小心将培养皿转移至27°C培养箱中，以促进胚胎正常发育。
12. 可根据需要定期观察胚胎。当利用移植技术进行功能获得和/或表型挽救实验时，所观察到的某些形态学变化可能源于移植操作本身的影响，因此需进行多次移植实验。移植后2-3天，卵黄囊、头部、眼睛和躯干上应出现黑色素细胞。若在移植胚胎中观察到上述现象，则很可能已成功构建嵌合体（图3）。

如有必要，通过将供体胚胎转移至含有25μl 20mg/ml蛋白酶K的PCR管中进行基因型鉴定。55°C孵育4小时，随后94°C孵育10分钟，然后进行PCR反应。

5. 代表性结果

图 2. 琼脂糖包埋胚胎的示例位置。右侧为胚胎前端，视角为背侧。B 面板：可见位于胚胎体两侧的内皮细胞，该细胞由 fli 启动子驱动的 GFP 标记。

图3. 移植后胚胎的图像。图像A显示了移植后立即拍摄的供体与受体胚胎。右侧为供体胚胎，其囊胚层完全呈红色（箭头所示）；左侧为受体胚胎，其囊胚层中可见一小团红色移植细胞（箭头所示），易于识别。图像B显示了移植后约7小时（在27°C下培养）的两个受体胚胎。注意移植的细胞已从移植位点迁移，并现分散于整个囊胚层（箭头所示）。图像C显示了阶段29（约74小时）的受体胚胎。可见眼部的色素沉着，以及躯干和脑区的黑素细胞（箭头所示）。罗丹明标记的细胞可见定植于多个胚胎结构中，表明嵌合体已成功生成。

讨论

在本视频中，我们将演示如何对青鳉胚胎进行去壳处理并实施细胞移植。该技术是一种强大的方法，可用于生成嵌合胚胎，以研究基因/蛋白质在发育过程中的功能，并阐明目标基因/蛋白质作用的自主性。青鳉作为一种有用的脊椎动物模型系统，具有明确的命运图谱，且胚胎透明，非常适合应用于该技术。 体内 实时成像。移植可与显微注射技术结合使用（详见配套的 JoVE 实验方案《Medaka 胚胎的显微注射》），以便于观察移植细胞的行为。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胚胎培养基	试剂	本实验室制备	N/A	200ml 50倍浓缩液，1ml 1%亚甲蓝溶于H2O/10升反渗透水（50倍浓缩液配方：NaCl 14.7g，KCl 0.6g，CaCl2·2H2O 2.4g，MgSO4·7H2O 4.0g/1升反渗透水）
显微解剖镊	工具	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	尖端非常锋利，用于去除卵膜。
细粒度防水砂纸 - p2000粒径	工具	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	极细粒径，用于滚动或清洁带卵膜的胚胎。
3%甲基纤维素	试剂	Sigma	M 0512	高黏度，用于在移植过程中固定胚胎位置。
1X BSS	试剂	本实验室制备	N/A	20X BSS：130g NaCl，8g KCl，4g MgSO4·7H2O，4g CaCl2·2H2O，10mg酚红溶于1L MilliQ水，高压灭菌；500mM Hepes溶于MilliQ水，高压灭菌。使用前加入25ml 20X BSS和15ml 500mM Hepes（pH 7.0），加水至500ml，过滤除菌。
青霉素-链霉素	试剂	Gibco	15140-122	在孵育去卵膜胚胎时加入BSS中。
蛋白酶Pronase	试剂	Calbiochem	53702	用于去除卵膜。
孵化酶	试剂	本实验室制备	N/A	用于去除卵膜。
三卡因甲磺酸盐（TMS）	试剂	Sigma	A-5040	400mg三卡因溶于97.9ml蒸馏水和2.1ml 1M Tris中，pH调至7；使用时取4.2ml该溶液加入100ml洁净鱼缸水中。
3%超低凝胶温度琼脂糖	试剂	Sigma	A-2576	IX-A型。用于胚胎包埋以进行观察。
培养皿观察室	工具	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki玻璃底培养皿，直径35mm，带12mm观察窗。用于胚胎包埋观察。
显微操作仪	设备	Narishige	N/A	型号MN151。用于移植过程中细胞的取出与植入。
硼硅酸盐玻璃毛细管	工具	Harvard Apparatus	GC100-10T	用于制作移植针。
火焰/布朗微电极拉制仪	设备	Sutter Instrument Co.	Model P-97	用于制作移植针。