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如何在微电极阵列（MEAs）上培养、记录和刺激神经元网络

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DOI：

10.3791/2056

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2010年5月30日

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University School of Medicine, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Laboratory for Neuroengineering, Georgia Institute of Technology and Emory, University School of Medicine, 3Emory University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案提供了在微电极阵列（MEA）上建立、维护、记录和电刺激神经元培养物所需的全部信息。In vitro 神经网络能够在网络和细胞水平上提出具有生理相关性的问题，从而增进对脑功能及脑功能障碍的理解。

摘要

近一个世纪以来，全球许多神经科学家毕生致力于研究神经元网络的工作机制，以及其在多种疾病中为何会停止正常运作。相关研究包括神经病理学观察、结合遗传标记的荧光显微镜技术，以及对分离神经元和脑片制备样本进行的细胞内记录。本实验方案介绍另一种技术，即在微电极阵列（也称为多电极阵列，MEAs）上培养分离的神经元细胞。

与其它技术相比，使用该系统具有多种优势。在微电极阵列（MEA）上培养的离体神经元网络提供了一个简化的模型，可通过阵列中的多个电极施加电刺激序列来调控网络活动。由于网络规模较小，刺激的影响局限于可观测区域，而在完整组织制备中则无法实现这一点。细胞以单层形式生长，便于利用多种成像技术监测其形态变化。最后，MEA上的培养物在体外可存活一年以上，从而消除了其他培养技术所固有的明确时间限制。1

我们的实验室及全球其他实验室正在利用这项技术来探究关于神经元网络的重要问题。本实验方案的目的是提供在微电极阵列（MEA）上建立、维护、记录和电刺激神经元培养物所需的必要信息。In vitro 网络为在神经网络和细胞水平上提出具有生理相关性的问题提供了途径，有助于更深入地理解大脑功能及其功能障碍。

方案

A. 引言

人类大脑中有数十亿个神经元。每个神经元可能拥有数百到数千个连接，通常与许多不同的细胞相连。这些连接承载着使我们能够行走、弹钢琴、骑自行车、欢笑、哭泣和记忆的信号。在过去的一个世纪里，全球许多神经科学家毕生致力于研究神经网络如何工作，以及它们为何会在各种疾病中停止正常运作。

在应对这一看似难以完成的任务时，人们可以使用多种工具。早期的研究主要集中在神经病理学观察上，探讨人类和其他动物大脑中神经回路的组织方式。荧光显微镜和遗传标记技术的出现，拓展了这些结构研究的范围，使研究深入到细胞组成乃至蛋白质和DNA水平。

但这些实验并未涉及大脑的动态功能，仅关注了静态结构。为了理解持续的神经活动，目前常用的技术通常聚焦于通过细胞内记录来检测电生理活动。分离培养的单个神经元提供了一种有用的简化模型，然而该技术受限于对单个细胞记录时间较短。此外，该模型也无法提供关于网络中其他细胞的充分信息。来自啮齿类动物的脑片则提供了更为真实的模型，其中皮层结构得以保留。然而，这类脑片即使在培养条件下，寿命也有限，且在维持细胞结构完整性的同时保持其存活在技术上具有挑战性2。

另一种技术是在微电极阵列（也称为多电极阵列，MEA）上培养离体神经元细胞。神经元被接种到MEA上，其培养皿底部嵌有微电极。经过三周左右的培养，这些细胞会形成包含轴突、树突以及数百甚至数千个突触连接的神经元网络。相比其他技术，该系统具有多项优势。MEA上的离体神经元培养提供了一个简化的研究模型（其复杂程度约相当于单个皮质柱，而非完整的脑组织）。细胞以单层形式生长，便于利用多种成像技术观察形态学变化。通过阵列中的多个电极施加电刺激序列，可调控网络活动。由于网络规模较小，刺激的影响局限于可观测区域，而在完整组织制备中则难以实现这一点。最后，MEA上的神经元培养物在体外可存活一年以上in vitro，从而消除了其他培养技术所固有的明确时间限制1。因此，MEA上的神经元培养是研究神经元连接性的理想模型。

本实验室及全球其他实验室正在利用该技术探究神经网络的重要问题。目前利用此模型研究的神经过程包括网络动态、发育、学习与记忆、突触可塑性、兴奋性毒性、缺血以及神经退行性变。3-10 这些研究的发现可能对建立更有效的先天性畸形、癫痫、中风和阿尔茨海默病等人类疾病的治疗方法具有重要意义。本实验方案的目的是提供在微电极阵列（MEA）上建立、培养、记录和刺激神经元培养物所需的全部信息。最终目标是为研究人员提供一种手段，以在细胞和网络水平上提出具有生理相关性的问题，从而增进对大脑功能与功能障碍的理解，并最终推动影响神经元及其通讯方式的疾病治疗。

以下方案基于本实验室在微电极阵列上培养、记录和刺激神经元网络超过10年的经验。每一步骤均已优化，以促进长期存活且健康的神经元网络的形成。在可查证的情况下提供了参考文献，部分最佳参数则为本实验室通过实验经验确定。在开始本方案之前，请获取所需的仪器和耗材，并按照“材料”部分列出的内容配制相应溶液。“脑组织解剖”部分将简要讨论，但在配套视频中不作演示，因该主题已有其他《视觉化实验杂志》文章涵盖11。

B. 脑组织解剖

  1. 从胚胎第18天（E18）的大鼠中取出全脑。对妊娠时间明确的雌性大鼠使用吸入式异氟烷麻醉后断头处死。取出胚胎并根据美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》进行解剖，所用方案经埃默里大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
  2. 在无菌操作条件下，将胚胎大脑取出并置于含有冷汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的100 mm无菌培养皿中。后续解剖步骤在层流罩内的解剖显微镜下进行，以最大限度降低污染风险。
  3. 将大鼠大脑逐个转移至另一含有HBSS的无菌培养皿中进行解剖。在HBSS中浸泡状态下，切除脑干、丘脑和小脑，并将大脑半球沿中线切开为两部分。
  4. 利用嗅结节作为夹持部位，固定大脑半球，轻柔地去除脑膜。
  5. 随后将皮层从下方的海马和纹状体上剥离，并置于冰上的无菌15 ml锥形管中，保存于Hibernate溶液中。12 由于通常存在多个胚胎，因此根据所需接种的微电极阵列（MEA）数量及目标细胞密度，重复上述操作。如后文所述，皮层组织将在细胞解离过程中合并使用。皮层组织可在4°C的Hibernate溶液中保存最多24小时，解离前仅出现轻微的细胞活力下降。除自行解剖获取组织外，也可从Brain Bits公司购买已解剖好的脑组织（www.brainbitsllc.com）。

C. 微电极阵列制备与皮层组织解离

  1. MEA 来自 ALA Scientific（www.alascience.com），制造商Multi-Channel Systems的供应商。MEA有多种不同配置，电极排列方式和间距各异，有的包含内部接地电极，有的则无；有的带有玻璃环，有的不带；玻璃环的尺寸也各不相同。在我们的基础实验中，采用标准微电极阵列，其包含60个电极，呈8×8网格排列，并带有小型玻璃环。氮化钛电极的直径为 30 μm 电极中心之间的距离为 200 μm其中一个电极较大，作为接地电极或内部参比电极。在操作多电极阵列（MEA）时，至关重要的是，任何固体物品（例如移液器吸头、纸巾或橡胶刮刀）均不得接触培养皿内部，以免损坏电极。有关MEA及其操作的更详细信息可参见MEA用户手册（www.multichannelsystems.com/products-mea/microelectrode-arrays.html).
  2. 在细胞制备前一晚，将微电极阵列（MEA）用去离子水冲洗，随后在70%乙醇中浸泡15分钟。然后将培养皿置于超净工作台中，并开启紫外灯过夜照射。为便于操作，每个MEA均置于标准的100 mm无菌聚苯乙烯培养皿中，并在培养皿上标注日期和标签。需要注意的是，其他灭菌技术包括高压灭菌和使用水处理等 90°C 如MEA用户手册中所述。然而，我们通过实验发现，高压灭菌似乎会减少MEA的可重复使用次数。如果要重复使用当前带有细胞培养物的MEA，则必须去除有机物质。300-400 μl 0.25%胰蛋白酶的PBS溶液在MEA上于35-37°C 孵育20分钟。用去离子水冲洗MEA，然后在光学显微镜下检查。如果仍有细胞残留，则重复胰蛋白酶处理步骤直至洁净。若培养皿已洁净，则按上述方法进行灭菌步骤。通常情况下，MEA在适当维护下可多次重复使用。
  3. 同样在铺板前一晚，需准备MEA盖并进行高压灭菌。这些盖为定制，也可从ALA-Scientific公司购买。它们由聚四氟乙烯（Teflon）制成，顶部覆盖一层透明膜（氟化乙烯-丙烯Teflon），该膜可允许气体扩散，同时限制水分扩散，从而基本无需使用加湿环境，并防止蒸发和高渗带来的有害影响。1
  4. 上述解剖步骤完成后，继续通过放置MEA来进行准备 100 μl 将聚乙烯亚胺（PEI）溶液加入每个MEA的中心。13 在我们实验中，与使用多聚赖氨酸相比，PEI溶液可减少MEA上的细胞聚集。将培养皿置于超净台中，室温下静置30分钟，皿盖轻轻覆盖在MEA上以防止蒸发。需要提醒的是，任何涉及开放MEA或脑组织的操作均应在标准细胞培养用超净台内进行，以最大限度降低污染风险。
  5. MEA 随后用 1–2 ml 无菌去离子水冲洗 3 次。理想的超净工作台配置应包括用于从培养皿中移除液体的抽吸装置。无菌 200μl 可将移液器吸头连接至抽吸管路。抽吸时请勿接触MEA表面，以免损坏电极。最后一次冲洗后，将MEA置于超净工作台中至少干燥30分钟。
  6. 在此干燥期间，将皮层组织放入含有2 ml木瓜蛋白酶溶液的15 ml无菌锥形塑料离心管中，开始神经元的分离过程。1 50 μl 加入DNA酶至混合物中。将小瓶置于35-37°C 孵育约20分钟。每5分钟轻轻敲击溶液以混匀，注意避免产生气泡。随着消化进行，皮质组织应逐渐呈现毛绒状外观。
  7. 用移液器小心吸除木瓜蛋白酶溶液，使脑皮层组织留在15 ml锥形管中。向脑皮层组织中加入2 ml细胞培养基，孵育2–3分钟，然后轻轻吸除。此步骤旨在洗去残留的木瓜蛋白酶，同时培养基中的血清也可抑制其活性。再次向脑皮层组织中加入2 ml细胞培养基，将样品在高速下涡旋振荡5–10秒。此时15 ml锥形管底部应出现浑浊的悬液，且无可见脑组织碎片残留。 alternatively，也可使用P-1000手持移液器，以1 ml培养基反复吹打3次，以解离组织。1 为实现充分的吹打混匀，每次移液操作应持续一秒钟。
  8. 然后让溶液缓慢通过无菌的 40μm 通过重力作用将细胞悬液过细胞滤网。使用P-1000移液器，逐滴缓慢地将细胞悬液加入滤网中。用35 mm无菌培养皿收集滤过的细胞悬液。
  9. 将细胞悬液转移回15 ml锥形管中，并加入细胞培养基至终体积为4.0 ml。14
  10. 500 μl 用P-1000将5% w/v的BSA溶液小心地铺至15 ml锥形管底部。14 这将使含有细胞的溶液在小瓶中向上移动。
  11. 将含有底层BSA的细胞悬液在200 × g下离心6分钟，以去除小碎片及潜在的有毒胞内成分。14
  12. 在细胞离心步骤期间，需目视评估MEA，以确保其完全干燥。 20 μl 将层粘连蛋白溶液小心地置于MEA的中央，确保覆盖所有电极。1 避免在此溶液中引入气泡，因为这可能导致电极表面制备不充分。如果微电极阵列（MEA）未完全干燥，则层粘连蛋白液滴会在培养皿表面扩散，使得在接种细胞时难以将其充分定位在电极上方。此步骤极为精细，若操作不稳或注意力不集中，可能导致MEA表面受损。
  13. 此时将特氟龙盖子盖在MEA上，以防止层粘连蛋白蒸发。盖上盖子的操作也需轻柔。只有当MEA置于完全水平的表面上时，才能放置或取下盖子。否则，不平整表面施加的额外作用力可能导致阵列的玻璃底部破裂，从而使设备无法使用。随后将培养皿放入培养箱中孵育20分钟。
  14. 在层粘连蛋白与培养皿结合的同时，将装有细胞的15 ml锥形管从离心机中取出，并转移回超净工作台。管底应可见细胞沉淀。使用无菌的5 ml塑料移液管小心吸除上清液。保留上清液，以防离心过程不完全。随后，用P-1000移液器轻柔吹打或短暂涡旋，将沉淀在300–500 μl 根据预期产量调整细胞培养基的用量。 10 μl 去除细胞悬液并置于血细胞计数板上，以确定细胞浓度。如果产量较低，应在显微镜下分析上清液，判断离心步骤是否不完全，可能需要重复离心。如果产量较高，则可能需要进行稀释，以实现更准确的计数。每张微电极阵列（MEA）的细胞接种密度可在5,000至300,000个细胞之间调整。计算稀释比例，使接种所需数量的细胞最终体积为15-20 μl通常使用每微升1000至3000个细胞的终浓度 μl一对皮层通常可获得 1000 万至 1500 万个细胞。若使用吹打法，此数目可能略低。
  15. 此时，MEA 上的层粘连蛋白孵育应已结束。移除 MEA 的聚四氟乙烯盖，用真空抽吸或移液方式除去大部分层粘连蛋白液滴。随后加入 15-20 μl 所需细胞悬液立即用移液器滴加到层粘连蛋白的残留湿润区域。注意避免在此少量细胞悬液中引入气泡，因为气泡会阻碍细胞均匀覆盖所有电极。轻轻盖上盖子，将多电极阵列（MEA）小心放回培养箱中孵育30分钟。随后在光学显微镜下检查培养皿，确保细胞已贴壁并覆盖所有电极。若仍有电极未被覆盖，可添加更多细胞，并将MEA连同盖子一起放回培养箱，使新加入的细胞得以贴附。若细胞悬液在静置数分钟后再次使用，务必轻轻旋转混匀，以重新悬浮已沉降的细胞。当电极覆盖达到理想程度后，缓慢加入1 ml温热（35–37°C) 细胞培养基。更换特氟龙盖后，将培养皿放回培养箱。由于层流罩会迅速蒸发MEA上的微量层粘连蛋白溶液和细胞悬液，因此需注意用特氟龙盖将其密封。密封后的MEA应置于含5% CO₂的培养箱环境中为宜2，9% O₂2 35–35°C 下 65% 湿度37°C低氧张力对于长期培养至关重要，可减少氧化损伤。12 保持65%的湿度可减少通过聚四氟乙烯（Teflon）膜的蒸发（相较于无湿度控制的情况），并允许MEA电子设备在培养箱中使用，而不会因水汽冷凝造成损坏（普通培养箱通常加湿至饱和状态）。

D. 更换细胞培养基并维护MEA上的解离培养物

  1. 细胞接种后的第二天，在光学显微镜下检查多电极阵列（MEA）培养皿。如果培养基颜色仍为粉红至红色，且细胞碎片和细胞死亡较少，则可将首次换液时间推迟一天。然而，如果培养基开始呈现更明显的橙色或黄色和/或存在大量细胞碎片和细胞死亡，则应立即更换培养基。所有换液操作均应在标准的细胞培养超净工作台中进行。
  2. 首次换液操作包括：取下MEA盖子，吸除培养皿中的全部培养基，加入等量新鲜细胞培养基，然后重新盖上盖子。首次换液时应完全更换全部培养基，以清除接种过程中残留的细胞碎片。后续换液操作仅需吸除约一半培养基，再补充等量新鲜培养基。此方法可保留部分细胞分泌至培养基中的生长因子，从而维持更佳的生长环境。若在换液过程中发现盖子内侧被污染，或盖子出现破损或密封不严，应更换新的经高压灭菌的盖子。细胞培养基可储存在培养箱内的无菌容器中，容器盖需经过定制改造（带有聚四氟乙烯（氟化乙烯-丙烯）膜，以允许气体交换）。培养基也可在4°C下保存，但在换液前需提前放入培养箱中预热并平衡温度。
  3. 每周约两次，更换培养皿中约一半的培养基。某些细胞制备条件可能导致培养基颜色变化较快，需更频繁地换液。若发现培养基变黄，则应完全更换全部培养基。培养基迅速变黄也可能是污染的征兆，因此应使用光学显微镜检查培养皿，观察是否存在感染的可视迹象。
  4. 根据实验条件和无菌操作技术的不同，精心维护的细胞培养物可存活一年以上。1

E. 从多电极阵列记录信号

  1. 每个MEA包含59个记录电极和一个内部接地电极。目前有多种商用记录系统以及定制版本可供选择。供应商包括Multi-Channel Systems、Tucker Davis Technologies、Axion Biosystems、Alpha Med Scientific MED64、Plexon、Ayanda Biosystems和BioLogic。本实验室目前使用的是来自Multi-Channel Systems的商用设备，以及一套定制设计的基于Windows系统的装置，名为NeuroRighter。15，以及一个基于 Linux 自主设计的系统，名为 MeaBench16每个系统均能够使用Multi-Channel Systems的前置放大器对MEA（多通道系统）进行记录。此外，还使用了一套Tucker Davis Technologies公司的商用设备。本方案将演示如何使用NeuroRighter进行MEA记录。NeuroRighter软件为开源软件，可免费下载，其硬件设计亦可在NeuroRighter Google小组中获取。http://sites.google.com/site/neurorighter/)
  2. 在多电极阵列上培养的细胞需要2-3周时间达到稳定的活动状态。17,18 该活动包括自发性动作电位以及全培养物范围的簇状放电（即一系列动作电位通过突触连接在培养物中扩散传播）。然而，实验的具体性质将决定最佳的培养天数。 体外 在记录之前。
  3. 神经元活动依赖于理想的环境条件，包括温度和pH值。1 因此，我们的记录在上述培养箱中进行。如果实验时间较短（<30 分钟）的设计，还有一种可商业购买的加热模块，可连接至MCS前置放大器，以维持MEA的理想温度。
  4. 开始记录时，将MEA（仍置于培养皿中）从储存用培养箱轻柔地转移至记录用培养箱。保持培养皿底部与地面平行。避免对MEA进行快速移动或产生震动，以免导致培养物从基质上脱落。随后将MEA从培养皿中取出，并放置于记录前置放大器上。将当前演示所用培养皿中的内部接地电极与前置放大器上的接地电极对齐（MCS前置放大器对应通道CR15）。使用蘸有70%乙醇的纸巾或棉签擦拭MEA周边的电极接触点，以清除指纹或其他可能影响良好连接的残留物。确认MEA已正确就位后，将前置放大器盖板放下并扣紧。前置放大器盖板上的接触点应牢固地压在MEA的电极接触焊盘上。目视检查接触对准情况，必要时可用棉签进行调整。将前置放大器放置于培养箱内的珀尔帖装置上。该装置由两块铜板组成，中间夹有珀尔帖热电泵。我们通常以约5 V电压运行该装置，以散除前置放大器电路产生的部分热量。此举可防止聚四氟乙烯膜盖内表面形成冷凝水。任何冷凝现象均可能导致培养环境受损，因培养基与细胞接触时发生蒸发，引起渗透压升高。通过确保前置放大器和培养基温度比培养箱内空气温度低一到两度，可使渗透压变化最小化。
  5. 打开 NeuroRighter 的电源，并在工作站上启动软件。调整 NeuroRighter 的设置以 体外 配备适当的软件/硬件配置后，在软件中选择电极数量。为降低背景噪声，可启用数字带通滤波器。如需保存数据以供后续分析，请打开记录开关并选择数据文件。完成所有适当设置后，点击启动按钮。
  6. 屏幕上应显示持续的活动轨迹和背景噪声。偶尔可见动作电位以及全培养皿范围的活动爆发。下文关于MEA记录的故障排除部分将讨论若未观察到预期活动时可能出现的几种常见问题。
  7. 屏幕视图可切换至尖峰检测模式（“Spk Wfms”标签页），在此模式下，动作电位以3毫秒时间窗口静态显示。对于某一特定通道，真实的细胞外动作电位持续时间约为1毫秒，且应以相同方向（正向或负向）重复发放。偶尔，同一电极上可能记录到两个或多个具有不同极性的神经元。持续时间短且极性可变的尖峰信号可能为伪迹。图1展示了尖峰数据的点阵图。
  8. 屏幕视图可切换为局部场电位（LFPs），以帮助定位爆发性活动的起源。在记录过程中，此类设置可能更具实用性 体内 由于单层培养的局部场电位（LFP）较弱。需要注意的是，某些前置放大器（包括我们使用的Multi-Channel Systems公司的产品）在10 Hz处设有高通滤波器，会衰减较低频率的LFP节律。

F. 在微电极阵列上刺激神经元网络

  1. MEA 上相同的 59 个记录电极也可用于对培养物进行刺激。实验的性质将决定刺激的程度。由于 NeuroRighter 采用开源代码，因此在刺激实验设计方面具有灵活性。15
  2. 对培养物进行刺激的难点在于，刺激会产生持续数毫秒的伪迹。这种伪迹可能足够大，从而触发尖峰检测，并掩盖刺激响应。NeuroRighter 采用 SALPA 算法来最小化甚至在某些情况下基本消除刺激伪迹。19
  3. 为了在 MEA 上刺激神经元网络，请在“记录设置”选项卡下训练 SALPA 算法以限制刺激伪迹。在“在线设置”选项卡中激活 SALPA。选择文件名并点击“开始”按钮以开始记录。然后点击“刺激”选项卡。此页面提供了多种刺激设置选项。
  4. 一个简单的实验是在“开环”部分刺激一个电极，并观察培养皿的响应情况。选择频率、电压、相位宽度和通道编号。按下开环部分的“开始”按钮。该刺激的响应可在主“尖峰”选项卡和“尖峰波形”选项卡中可视化，并可在数据文件中进行分析。
  5. 实时观察中，可在多个电极上以每秒一次、0.5 V 的刺激实现时间锁定的簇状放电。图 2 显示了刺激后响应的点阵图。先前的研究表明，存在两种不同类型的刺激诱发活动：直接诱发的动作电位（dAPs）和突触诱发的动作电位（sAPs）。20
  6. 培养中的神经元具有自发的簇状放电活动。对于某些实验，此类放电可能干扰对网络动态的控制。有趣的是，每个电极以 1–2 Hz 的频率进行分布式刺激，可开始抑制 MEA 上神经元网络中的簇状放电活动。21

G. 微电极阵列记录的故障排除

  1. 软件启动后，MEA 上未出现动作电位或簇状放电：
    1. 培养时间是否足够？在培养的第一周接近结束时应能观察到动作电位 体外爆发现象通常发生在两到三周左右 体外.
    2. 硬件是否已通电？NeuroRighter 系统使用两块 6V 铅酸电池为硬件供电。电源开关需处于开启状态，且电池需已充电。
    3. 培养物是否存活？有时这可能难以判断，尤其是在细胞密度较高或培养时间较长的培养物中，由于胶质细胞过度生长，会增加判断难度。然而，可以通过相差显微镜观察是否存在形态健康的神经元（具有明亮、椭圆形胞体）以及完整（而非断裂）的细胞突起。如果培养物出现可见污染迹象，或培养基迅速降解（换液后仅1至2天即变酸），也可能表明培养存在问题。
    4. 电极阻抗是多少？经过多次使用后，微电极或MEA的绝缘层可能会退化。NeuroRighter具备评估电极阻抗的能力。15 在1 kHz左右的正常阻抗读数应在10,000至100,000欧姆之间。阻抗过高提示导联线或电极断裂，而低于10,000欧姆的读数则提示绝缘不良。
    5. 前置放大器是否已连接到硬件板？前置放大器应有一根输出电缆连接至硬件板。前置放大器还配有4个小的刺激器板，这些刺激器板同样连接至主硬件板，且仅在进行刺激时起重要作用。
    6. NeuroRighter 软件设置是否已被更改？软件中的硬件配置设置必须正确，记录才能正常工作。安装更新版本或多个用户更改设置均可能导致此问题。
    7. MEA 是否处于 35-37°C较低的温度可能导致皮层网络的自发活动减少。这种情况通常不会成为问题，因为记录是在气候受控的培养箱内进行的；但如果多电极阵列（MEA）在培养箱外放置超过数秒，则必须预留足够时间使其温度重新平衡。
    8. 过去几小时内是否更换过培养基？我们观察到，培养物在换液后常会停止放电数小时。因此，最好在换液前进行实验。
  2. 电极背景噪声过高，导致记录窗口饱和：
    1. 前置放大器针脚与MEA电极的接触是否充分？此问题可能由前置放大器盖上针脚错位、微小异物、培养基液滴、电极表面退化或盖子上的透明膜重叠引起。首先应检查是否存在上述问题。使用浸有70%乙醇的棉签调整针脚有时可改善接触，特别是当存在需要清除的培养基液滴时。但在乙醇完全蒸发前，信号质量可能暂时变差。
    2. 电极是否看起来已损坏？在光学显微镜下观察有时可发现电极绝缘层出现裂纹或凹坑，从而导致此类伪迹。
    3. 记录电极的接触垫是否磨损或划伤？有时多电极阵列（MEA）上的某些电极接触点可能难以优化，这种情况在多次使用和镀膜后更为常见。一种含金丝的橡胶垫片仅在其0.5 mm厚度方向导电，可改善前置放大器针脚与MEA之间的接触。该材料可从Fujipoly公司获取，并可裁剪成适合MEA及盖板的尺寸。
  3. 整个MEA显示过高的背景噪声：
    1. MEA 的方向是否正确，以确保 MEA 上的接地电极能够接触到前置放大器上的接地针？如果 MEA 方向正确，则还需考虑是否存在接地接触问题（如上述 2 a-c）。通道 CR15 是否使用短导线连接到前置放大器机壳进行接地？使用跳线通过内部 30 kOhm 电阻接地可能会引入过多噪声。
    2. 周围光源、电源或其他设备是否存在干扰？最常见的干扰形式之一是来自灯光和设备的 60 Hz 干扰。记录系统必须正确接地。对暴露的电缆进行屏蔽也有助于降低背景干扰。

代表性结果

神经元网络活动图；簇发放电分析，时间与通道关系；电生理学研究。
图1. 这是神经元网络持续2分钟的自发活动的点阵图。每个黑点代表一个动作电位。蓝色箭头标示了两次簇发放电活动。多个电极上的响应取决于网络的连接性。

刺激诱发的神经网络活动图；时间与通道；脑信号分析。
图 2. 此处为16秒刺激诱发活动的点阵图。红色星号代表刺激。红色箭头指示五个成功在多个电极上诱导出突触活动簇的刺激。偶尔，某些刺激未能引发簇活动，如蓝色箭头所示。

讨论

本方案介绍了如何在微电极阵列上培养和维持神经元网络，以及记录和刺激神经元网络的基本方法。MEA 故障排除部分还讨论了使用 MEA 进行记录时一些常见问题。在整个方案中提及了一些偶尔的步骤变异，这些调整通常用于优化特定实验设计所需的条件。

尽管此处介绍的记录与刺激系统由我们自行设计的 NeuroRighter15 与 MCS 前置放大器组成，但还有多种其他系统也可提供与神经元网络的接口。具体选择何种装置取决于实验的具体需求。

本方案提供了简化的记录与刺激示例，但基于微电极阵列的神经元培养体系可用于探究突触活动及神经元网络连接性等复杂问题。如上所述，目前已有研究利用该技术探索细胞可塑性、发育过程、兴奋性毒性及神经退行性变等生物学过程。6-10 例如，我们实验室最近发表的一项研究展示了可重复的目标导向学习 体外 根据当前神经网络活动进行实时闭环刺激3.

尽管MEA培养物通常较为敏感且脆弱，但由于其结构简单且易于操作（相较于完整的动物模型），它们为在神经网络水平上研究神经元活动提供了一个强有力的模型。

披露

CMH 没有需要披露的内容。
JDR 和 SMP 是 Axion Biosystems 的付费顾问。
本文及视频的投稿费用和视频处理费用由 Multi-Channel Systems 慷慨赞助。

致谢

我们感谢Potter团队成员对本方案提供的宝贵意见。本研究由美国神经病学学会基金会临床研究培训奖学金资助CMH，由美国国立普通医学科学研究所（NIGMS；http://www.nigms.nih.gov/）资助JDR（GM08169），美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所（NS054809）资助，JDR获得露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖（NS060392），美国国家科学基金会EFRI资助（0836017），库尔特基金会转化研究奖，以及JDR获得的转化研究奖学金（NS007480）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论

耗材

  • 一次性瓶顶过滤器（150 ml，0.2 μm）μm 孔径；Nalgene #565-0020
  • 妊娠18天的雌性大鼠
  • 微电极阵列–微电极阵列（见方案B1中的描述）
  • 微电极阵列–电极阵列盖子（见方案B3中的描述）
  • 尼龙细胞筛（40μm，BD Falcon，#352340
  • 聚丙烯圆锥形离心管（无菌，15 ml）
  • 聚苯乙烯培养皿（无菌，35 mm 和 100×15 mm）
  • 移液器吸头（无菌，20μ1, 200μ1 和 1000μl)
  • 血清移液管（5 ml）

设备：

  • 生物安全柜/层流罩
  • 细胞计数器
  • 离心
  • 冰盒
  • 解剖剪和镊子（已灭菌）
  • 超净工作台中的解剖显微镜
  • 手持式电动移液器
  • 血细胞计数板
  • 异氟烷和气体室
  • 光学显微镜
  • 手持式移液器（P-20（20μ升），P-200（200μl), P-1000 (1000μl))
  • MEA记录系统（见方案D1中的描述）
  • 啮齿类动物断头器
  • 三气培养箱（见方案 B15 中的描述）
  • 通风橱内连接抽吸器的真空瓶
  • 涡旋震荡
  • 水浴（35-37 ℃）°C)

溶液与试剂：

BSA 溶液：

将5% BSA（Sigma A-9418）溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，并通过0.2 μm滤膜过滤μm. 该溶液可预先配制，并在 4℃ 保存°可维持数月。

细胞培养基：

将90 ml Dulbecco’s 改良伊格尔’s 培养基（Irvine Scientific 9024），10 ml 马血清（Gibco 16050），1 ml 丙酮酸钠（100 mM，Gibco 11360），250 μl GlutaMAX（Gibco 35050）和胰岛素（终浓度 2.5） μg/ml，Sigma I-5500），然后经 0.2 μm 滤膜过滤 μm 滤器。22 使用前将细胞培养基在培养箱中预热并平衡。

用于制备木瓜蛋白酶溶液的解离溶液：23

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解剖液（100 ml 储存液） 按顺序混合，0.22 微米滤膜过滤 μm，并在4℃保存°C.
组分体积 ml终浓度（mM）
双蒸水91.175
1 M MgCl20.585.8 mM
1 M CaCl₂20.0250.25 mM
0.5 M HEPES0.321.6 mM
0.5% 酚红0.2(0.001%)
0.1 N NaOH0.20.2 mM
2 M Na2SO44.590 mM
1 M K2SO43.030 mM
0.1 M 犬尿烯酸1.01 mM
5 mM APV1.00.05 mM

该溶液可预先配制，并在4℃保存°数月

DNAse I：

Invitrogen (#18047019)。50μl aliquots 经速冻后于 -80 保存°C. 在开始细胞解离过程之前，于超净工作台中解冻一份 aliquot。

汉克’平衡盐溶液：

Sigma（#4891）。使用去离子水配制1X溶液，并通过0.2 μm滤膜无菌过滤。μm 并在 4 ℃ 下保存°C.

Hibernate溶液：

于培养当天配制。将98 ml L-15培养基（Invitrogen 11415）与2 ml B-27添加剂（50倍浓度，Invitrogen #17504）混合，并通过0.2 μm滤膜过滤 μm

层粘连蛋白溶液：

培养当天准备。稀释20μl 的层粘连蛋白（1 mg/ml，Sigma L-2020）加入 980 μl 细胞培养基，终浓度为 0.02 mg/ml。20 μlaminin（1 mg/ml）的 aliquots 储存于 -80 ℃°C，并在使用前立即解冻。解冻应在实验台面上进行，而非水浴中，因为快速解冻有时会导致层粘连蛋白（laminin）发生凝胶化。

木瓜蛋白酶溶液：23

将10 ml解剖液（上述）加热至30–32℃°C. 加入200单位木瓜蛋白酶（Sigma P-4762）和1.6 mg L-半胱氨酸（Sigma C-7880）。用约14 μ0.1 N NaOH 溶液。孵育约 30 分钟，直至溶液变澄清，经 0.2 μm 滤膜过滤 μm，用液氮将2 ml分装至15 ml聚丙烯无菌锥形管中速冻，并于-80℃保存°C. 在35-37℃下解冻一份样品°开始实验方案前的 C。

聚乙烯亚胺（PEI）溶液：13

100 μ将1毫升PEI（50% w/v，Sigma P-3143）溶于100毫升硼酸钠缓冲液（0.1 M，pH 8.4，Sigma B-9876）中，终浓度为0.05% w/v。使用0.2 μm滤膜无菌过滤。 μm。可预先配制，并在4℃保存°数月

无菌去离子水：

高压灭菌，使用前冷却至室温。

胰蛋白酶（0.25% 含 EDTA，Gibco 25200）：

1 ml 分装样品经快速冷冻后，于 -80 保存°C. 将分装样品在35-37℃下解冻°使用前将水浴预热至 C。

参考文献

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