使用微阵列进行细菌基因表达分析

方案

逆转录反应

将加热块调至70-80°C和42°C。此步骤也可使用水浴。若使用加热块，请加入适量水以确保受热均匀。

1. 预变性反应
   1. 取 3 μg RNA
   2. 用无RNase的水将体积调至 13 μl
   3. 加入 2.5 μl 随机六聚体引物（2mg/mL）
2. 充分混匀，于 70–80°C 孵育 8 分钟，随后置于冰上冷却 5 分钟。
3. 配制反转录（RT）反应液（每反应 14.5 μl）：
   
   

   组分	体积
   5X 第一链缓冲液	6 µl
   0.1 M DTT	3 µl
   25X 氨基烯-dNTP 混合物	1.2 µl
   SuperScript II RT（200U/µl）	2.3 µl
   水	2.0 μl

   
   * 对于 n 个反....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-氨基烯丙基)-2’脱氧尿苷-5’三磷酸
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP 混合液，PCR 级
随机六聚体引物		Amersham	27-2166-01	3 mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200 U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	标记后反应性染料试剂盒
QIAquick		Qiagen	28104	PCR 纯化试剂盒
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	缓冲液			配制 1 M 磷酸盐缓冲液（KPO4，pH 8.5–8.7）：取 9.5 mL 1 M K2HPO4 与 0.5 mL 1 M KH2PO4 混合
磷酸盐洗涤缓冲液	缓冲液			配制 100 mL 磷酸盐洗涤缓冲液（5 mM KPO4，pH 8.0，80% EtOH）：混合 0.5 mL pH 8.5 的 1 M KPO4、15.25 mL MilliQ 水和 84.25 mL 95% 乙醇。缓冲液将略显浑浊。**重要提示：磷酸盐洗涤缓冲液需每日新鲜配制。
磷酸盐洗脱缓冲液	缓冲液			用无菌水将 pH 8.5 的 1 M KPO4 稀释至 4 mM
碳酸钠缓冲液				（Na2CO3）：0.5 M，pH 9.0。将 4.2 g NaHCO3 溶于 80 mL 无菌水中，用 10 N NaOH 调节 pH 至 9.0，再用无菌水定容至 100 mL。用于染料偶联反应时，用水稀释 10 倍得到 50 mM 溶液。注意：碳酸盐缓冲液会随时间改变组成，建议每两周至一个月新鲜配制一次。