逆转录反应
将加热块调至70-80°C和42°C。此步骤也可使用水浴。若使用加热块，请加入适量水以确保受热均匀。
- 预变性反应
- 取 3 μg RNA
- 用无RNase的水将体积调至 13 μl
- 加入 2.5 μl 随机六聚体引物（2mg/mL）
- 充分混匀，于 70–80°C 孵育 8 分钟，随后置于冰上冷却 5 分钟。
- 配制反转录（RT）反应液（每反应 14.5 μl）：
组分 体积 5X 第一链缓冲液 6 µl 0.1 M DTT 3 µl 25X 氨基烯-dNTP 混合物 1.2 µl SuperScript II RT（200U/µl） 2.3 µl 水 2.0 μl
* 对于 n 个反应，建议配制 n+0.5 份的总反应液（Master Mix），以确保用量充足。 - 向已冷却的反应体系中加入 14.5 μl RT 反应液。
- 轻轻混匀（切勿涡旋），于 42°C 孵育 3–4 小时。
- 如需保存，样品可置于 -20°C 条件下。
水解 RNA
- 向每个样品中加入 3 µl 的 1 N NaOH 和 0.6 µl 的 0.5 M EDTA。（终浓度 = 100 mM NaOH，10 mM EDTA）
- 混匀后于 65°C 孵育 10 分钟。
- 加入 33.6 μl 的 1 M HEPES（pH = 7.0）进行中和（终浓度 = 500 mM HEPES）
- 如有需要，样品可在 -20°C 保存。
反应纯化：去除未掺入的 aa-dUTP 和游离胺
注意：本纯化方案经由Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒方案修改而来。磷酸洗涤缓冲液和洗脱缓冲液替代了Qiagen提供的缓冲液，因为Qiagen的缓冲液含有游离胺，会与Cy染料偶联反应竞争。也可使用该试剂盒中的离心柱。
- 将cDNA反应产物与300 µl（或5倍反应体积 = 336 μl）缓冲液PB（Qiagen提供）混合，转移至QIAquick柱中。
- 将柱子放入2 ml收集管（Qiagen提供）中，以约13,000 rpm离心1分钟。弃去收集管中的废液。
- 洗涤时，向柱中加入750 µl磷酸盐洗涤缓冲液（非Qiagen提供），以约13,000 rpm离心1分钟。
- 弃去收集管中的废液，重复一次750 µl洗涤缓冲液的洗涤及离心步骤。
- 弃去收集管中的废液，将柱子在最大转速下再离心1分钟。
- 将柱子转移至一个新的1.5 mL微量离心管中，小心加入30 µl磷酸盐洗脱缓冲液。（参见溶液配制部分）
- 室温孵育1分钟。
- 以约13,000 rpm离心1分钟进行洗脱。
- 重复步骤6–8，用另外30 µl磷酸盐洗脱缓冲液进行第二次洗脱，收集至同一管中。最终洗脱体积应约为60 µl。
- 此时可对cDNA量进行定量：
cDNA含量（ng）=（稀释倍数）×（OD260）×（37）×（从柱子中洗脱的总体积） - 在45°C条件下使用真空浓缩仪干燥样品。
- 如需长期保存，样品可存放于-20°C。
将氨基酸-cDNA与Cy染料酯偶联
- 如有必要，用 10 μl 50 mM Na-碳酸氢盐缓冲液（pH = 9.0）重悬氨基烯基标记的 cDNA。（该缓冲液应每两周新鲜配制一次）
- 在避光环境中操作，将探针加入适量的 Cy 染料管中。用移液器吹打数次以充分重悬染料。
- 在室温避光条件下孵育反应体系 1 小时。（孵育时间最长可达两小时）
反应纯化 II：去除未偶联的染料
- 向反应体系中加入 35 µl 100 mM NaOAc（pH 5.2），充分混匀。
- 向每个样品中加入 250 µl（或 5 倍反应体积 = 225 μl）Buffer PB（Qiagen 提供），通过移液器上下吹打混匀。
- 将 QIAquick 离心柱放入一个 2 mL 收集管（Qiagen 提供）中，将样品加入离心柱中，以约 13,000 ×g 离心 1 分钟。弃去收集管中的液体。
- 洗涤步骤：向离心柱中加入 0.75 mL Buffer PE（Qiagen 提供），以约 13,000 ×g 离心 1 分钟。
- 重复步骤 4。
- 弃去收集管中的液体，将离心柱在最大转速下额外离心 1 分钟。
- 将离心柱放入一个干净的 1.5 mL 微量离心管中，小心地将 30 µl Buffer EB（Qiagen 提供）加至离心柱膜的中心位置。
- 室温孵育 1 分钟。
- 以约 13,000 rpm 离心 1 分钟，进行洗脱。
- 重复步骤 7–9，将洗脱液再次收集至同一离心管中。最终洗脱体积应约为 60 µl。
标记反应的分析
此时可以对cDNA和标记物的量进行定量：
- 测定 OD 260、550 和 650（空白对照为水），使用 Nanodrop 微阵列程序。
- 根据下方提供的公式计算染料掺入的 pmol 数、DNA 的 pmol 数以及核苷酸/染料比值：
核苷酸 pmol 数 = [OD260 × 体积 (μL) × 37 ng/μL × 1000 pg/ng] / 324.5 pg/pmol
注意：cDNA 的 1 OD260 = 37 ng/μL；dNTP 的平均分子量为 324.5 pg/pmol
Cy3 的 pmol 数 = OD550 × 体积 (μL) / 0.15
Cy5 的 pmol 数 = OD650 × 体积 (μL) / 0.25
核苷酸/染料比例 = cDNA 的 pmol 数 / Cy 染料的 pmol 数
如果使用 Nanodrop，它会直接给出每种染料的 pmol/μl 值。您只需将该数值乘以体积，即可得到染料标记的总 pmol 数。
注意：>150–200 pmol 的染料掺入量（每样本）且每染料分子对应的核苷酸少于20个的比率，适用于杂交反应。
- 样品可在 -20°C 避光保存。
- 将要杂交的探针混合，并在 42°C 下用真空浓缩仪干燥。
- 样品可在 -20°C 保存，直至准备进行杂交。
杂交前玻片
- 将载玻片正面朝下放置在洁净的红色载片架中，浸入100 mL室温水中，浸泡3-5分钟
- 将载玻片正面朝上置于100°C加热板上数秒，快速干燥——注意观察直至冷凝水完全消失
- 以250 mJoules进行紫外交联（在紫外交联仪中输入2500）
- 将载玻片浸入预热至42°C的水中进行水合，然后在室温下以700 RPM转速离心5分钟
- 将载玻片放入含有预热杂交前阻断液（5XSSC、1% BSA、0.1% SDS）的50 mL Coplin染色缸中，于42°C孵育至少45分钟；必要时可延长孵育时间。
50 mL 杂交前阻断液配方：12.5 mL 20x SSC，10 mL 5% BSA，0.5 mL 10% SDS，27 mL 水 - 将载玻片浸入预热的42°C水中，轻轻振荡数分钟，以彻底去除杂交前阻断液
- 用异丙醇冲洗载玻片，并在室温下以700 rpm转速离心5分钟，使其干燥
准备用于杂交的样品
- 将探针重悬于水中（体积如下所示）
总体积 = 30 μl 总体积 = 35 μl 总体积 = 40 μl 19.8 μl 水 23.55 μl 水 27.2 μl 水 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl 10 mg/ml 鲑鱼精DNA（Invitrogen） 1.2 μl 1.2 μl 1.2 μl 12.5 mg/ml tRNA 4.5 μl 5.25 μl 6 μl 20X SSC（终浓度为3X） 3 μl 3.5 μl 4 μl 1% SDS
注意：试剂的添加顺序至关重要。请勿配制预混液。 - 煮沸 5 分钟，然后在 14,000 rpm 下离心 5 分钟。在室温下冷却 2 分钟。
杂交
- 在杂交室每侧边缘及中间的孔中加入 10–12 µl 的 3X SSC。
- 将洁净的盖玻片置于玻片的适当区域，并轻轻加入杂交溶液（30–40 μl）。盖玻片两侧应有少量样品溢出。
- 将玻片放入杂交室中，拧紧螺丝，然后置于 65°C 水浴中过夜。切勿将杂交室直接放置在水浴底部。在最上层的杂交室上方放置一个支撑块以固定所有组件。保持水浴盖子关闭，以保护对光敏感的样品。
杂交洗涤
- 配制以下缓冲液：
- 1X SSC，0.05% SDS
- 0.06 X SSC
- 孵育结束后，打开杂交室。将载玻片从杂交室中取出，注意不要扰动盖玻片。
- 为去除盖玻片，将载玻片浸入盛有温热的1X SSC、0.05% SDS洗涤缓冲液的培养皿中，使盖玻片面朝向培养皿底部。通过左右移动载玻片，盖玻片将自行脱落。
- 去除盖玻片后，将载玻片放入装有新鲜温热1X SSC、0.05% SDS缓冲液的染色架中，振荡数分钟。
- 将载玻片连同染色架转移至0.06 X SSC的缓冲液浴中。
- 将载玻片转移至另一含有新鲜染色架的0.06 X SSC缓冲液浴中，在放入新缓冲液前，先用纸巾轻压载玻片以尽可能去除含SDS的缓冲液。
- 振荡载玻片数分钟。
- 立即在 室温下以700 rpm离心5分钟，随后载玻片即可进行扫描。在扫描前需避光保存。
