Method Article

慢性成像小鼠的视觉皮层使用减薄，颅骨的制备

DOI:

10.3791/2060

⸱

October 25th, 2010

 , 
1Neurobiology and Anatomy, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们在这个视频和补充材料，表现出对慢性协议在体内完好使用一个头骨变薄，准备的脑成像。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在体内成像，利用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）允许在完好的大脑活体细胞和神经元突起的研究。这里介绍的技术，允许在几个时间点与微观的决议，允许这是代表多数在中枢神经系统的兴奋性突触后网站的一小结构的树突棘的跟踪（慢性成像）的大脑同一区域的成像。能够清楚地解决以上几个时间点的优良的皮质结构有很多优点，特别是在大脑的可塑性，在突触和电路重塑的形态学变化可能有助于解释底层机制的研究。在这个视频和补充材料，我们将展示一个长期在体内的完整使用一个头骨变薄，准备的脑成像协议。薄头骨准备是一种微创的方法，从而避免了潜在损害的硬脑膜和/或皮质，从而减轻炎症反应的发生。当执行这个协议是正确的，它可以清楚地监测树突棘的特点，在经过一段时间的长期完整的大脑变化。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. 要完整的使用双光子显微镜，一个神经元与荧光标记物标记的准备的大脑中的神经元可视化使用。这里介绍在实验中，我们使用的GFP - M的转基因小鼠线，标签5层的锥体细胞。 5层的锥体细胞投射到表层的树突状进程，使树突和树突棘的可视化深度为300微米以下的PIA水平。另一种方法是使用病毒标志物（见洛厄等 。提交给朱庇特）标签细胞。
  2. 消毒工作区，使用70％的乙醇和高压灭菌器工具，无菌手术。支付业务用干净的敷料表面。
  3. 麻醉与芬太尼鸡尾酒（芬太尼0.05毫克/公斤;咪唑安定5毫克/公斤; metatomadin 0.5毫克/公斤）小鼠由Avertin季度剂量使用IACUC核准程序（0.0075毫克/毫升）。预处理小鼠的镇痛，丁丙诺啡（0.5毫克/公斤）皮下注射（SQ）。麻醉平面显示器的水平测试反应尾/脚趾捏。
  4. 保持动物在37.5 ° C加热毯使用带有附加直肠温度计。
  5. 眼药膏眼睛，防止眼睛干燥。用一张小纸罩的眼睛，保护眼睛在手术过程中光源。
  6. 用剪刀，去除头发从后脑勺（背后耳朵）眼睛。
  7. 清洁动物的连续应用70％乙醇的头顶部，其次是优碘擦洗和优碘解决方案。
  8. 背后的耳朵和向上的L型切割的切口，沿中线（取决于哪个半球成像）对眼睛的右边或左边。折叠皮肤远离手术的部位。不要清除皮肤成像会议将缝合皮肤。
  9. 用细镊子轻轻拉动皮肤，和远离你感兴趣的领域。
  10. 远离暴露头骨的面积用干净的镊子或显微刀片轻轻刮去骨膜。使用棉签，申....

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Discussion

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慢性成像，利用双光子显微镜技术正成为一个日益流行的技术，研究过程中的可塑性2-5引发的形态学变化。在这里，我们展示了一个薄的头骨的准备工作，按照不同的成像天在完整的小鼠大脑中确定的树突棘。在这个协议中，头骨是原封不动的，造成最小损害的皮质和neuroinflammation非常低的水平，这可能会改变大脑功能6。这使得动物成像后，立即在第一次手术，然后随后重新制作映像天至数年以后。这是一个强大的技术，但也有其局限性。愈创窗口的准备，其中包括一个开颅手术，并因此相关的胶质激活，允许重复的一个任意数量的成像会的脑成像，而颅窗口是明确的。颅骨薄的准备，但是，由于参与开幕式和闭幕式的老鼠的皮肤手术最多三个成像会议是有限的。此外，穿透深度是优越的颅窗口2。因此，应仔细考虑决定时采取的手术方法治疗慢性成像实验。

....

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作是由宝来惠康（AKM）在生物医学科学事业奖，白厅基金研究资助（AKM），斯隆基金会奖学金（AKM），美国国立卫生研究院EY019277（AKM），和聂资助，视力训练补助金，EY013319（ EAK）。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fentanyl CitrateIn HouseFentanyl Cocktail：麻醉鸡尾酒;
IP 剂量：0.0125 ml/g

最终鸡尾酒浓度：0.05 mg/kg
盐酸内部芬太尼鸡尾酒：麻醉鸡尾酒;
IP 剂量：0.0125 ml/g

最终鸡尾酒浓度：0.05 mg/kg
盐酸内部芬太尼鸡尾酒：麻醉鸡尾酒;
IP 剂量：0.0125 ml/g

最终鸡尾酒浓度：0.05 mg/kg
2,2,2-三溴–thanol Avertin 鸡尾酒：麻醉剂;
IP 剂量：0.0075 cc/ g

最终鸡尾酒浓度：1%
2-甲基-2-丁醇（最终浓度：0.775%）Avertin 鸡尾酒：麻醉;
IP 剂量：0.0075 cc/ g

最终鸡尾酒浓度：.775%
TC-1000 小鼠CWE， Inc.TC-1000 小鼠体温调节
Toberadex室内眼膏
10% 氯化Ricca Chemical Company3120-32薄颅骨制备
显微外科刀片Sable IndustriesS-6400薄颅骨制备
氰基丙烯酸酯 404,401乐泰P/N 46551薄颅骨制备
氰基丙烯酸酯 401乐泰P/N 40140薄颅骨制备
Zip Kicker 胶水加速器Pacer 技术PT-29薄颅骨制备
微钻钢毛刺 0.7mm 尖端直径精细科学工具19008-07薄颅骨制备
Microtorque 控制箱和 Tech2000 手机Ram Products 公司TECH2000ON/OFF薄颅骨制备
#6-0（0.7 公制）丝线缝合Ethicon Inc.K8894H锥形 C-1
眼部敷料镊子，10 厘米，尖端宽度 0.5 毫米，弯曲手术工具精细科学工具11152-10
超细波恩剪刀，8.5 厘米，直尖，刀刃 13 毫米手术工具精细科学工具14084-08
标准图案镊子，直，2.5 毫米 x 1.35 毫米尖端，12 厘米手术工具精细科学工具11000-12
美地托吧啶咪达唑仑温度控制系统 铁

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  2. Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4<....

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