使用磨薄颅骨制备法对小鼠视觉皮层进行长期成像

摘要

在本视频及补充材料中，我们展示了一种利用磨薄颅骨制备法对完整大脑进行长期在体成像的实验方案。

摘要

体内成像利用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）可实现对完整大脑中活细胞和神经元过程的研究。本文介绍的技术能够以显微分辨率对同一脑区在多个时间点进行成像（慢性成像），从而追踪树突棘——这些微小结构代表了中枢神经系统中大多数兴奋性突触后位点。在多个时间点清晰分辨精细皮层结构的能力具有诸多优势，尤其在脑可塑性研究中，突触形态变化与神经环路重塑可能有助于揭示其潜在机制。在本视频及补充材料中，我们展示了一种利用磨薄颅骨制备方法进行完整脑组织慢性体内成像的实验方案。磨薄颅骨制备是一种微创方法，可避免对硬脑膜和/或皮层造成潜在损伤，从而减少炎症反应的发生。当该方案正确执行时，可在较长时间内清晰地监测完整脑组织中树突棘特征的变化。

方案

1. 为了利用双光子显微镜观察完整脑组织中的神经元，需制备神经元标记有荧光标记物的样本。在本实验中，我们使用GFP-M转基因小鼠品系，该品系可标记第5层锥体细胞。¹5层锥体细胞将树突突起投射到浅层，从而可观察到最深达 300 μm 软脑膜水平以下。另一种方法是使用病毒标记物对细胞进行标记（参见 Lowery 等，已提交至JOVE。
2. 使用70%乙醇对工作区进行消毒，并将器械高压灭菌以用于无菌手术。用干净的敷料覆盖操作台面。
3. 使用芬太尼混合物（芬太尼 0.05 mg/kg；咪达唑仑 5 mg/kg；美托咪定 0.5 mg/kg）对小鼠进行麻醉，随后按照 IACUC 批准的操作程序给予四分之一剂量的 Avertin（0.0075 mg/ml）。麻醉前通过皮下注射（SQ）给予镇痛剂丁丙诺啡（0.5 mg/kg）进行预处理。通过尾部或脚趾夹捏反应监测麻醉深度。
4. 维持动物于 37.5°C 使用带有直肠温度计的加热毯。
5. 涂抹眼膏以防止眼睛干涩。手术期间用小片纸张遮盖眼睛，以保护眼睛免受光源照射。
6. 使用剪刀从耳后至眼睛处去除头部背面的毛发。
7. 用70%乙醇依次擦拭动物头部表面，随后用碘伏擦洗剂和碘伏溶液进行清洁。
8. 在耳后做一L形切口，沿中线右侧或左侧（根据将要成像的半球而定）延伸至眼睛。将皮肤向外翻折，远离手术区域。不要去除皮....

讨论

利用双光子显微镜进行慢性成像正成为研究可塑性过程中所触发的形态学变化的一种日益流行的技术^2-5。本文中，我们展示了一种减薄颅骨的制备方法，用于在不同成像日对完整小鼠脑内的特定树突棘进行追踪。在此方案中，颅骨保持完整，对皮层造成的损伤极小，从而引起极低水平的神经炎症，避免可能对脑功能产生干扰⁶。该方法允许动物在首次手术后立即进行成像，并可在数天至数年后重复成像。这是一种强大的技术，但也存在其局限性。相比之下，更为侵入性的开窗制备方法需进行颅骨切除术，因而会伴随胶质细胞的激活，但可在颅骨窗口保持清晰期间，实现任意次数的重复脑成像。而减薄颅骨制备方法由于涉及小鼠皮肤的切开与缝合手术，最多仅限于三次成像。此外，颅骨开窗法在成像深度穿透方面更具优势²。因此，在决定慢性成像实验的手术方案时，应仔细权衡各种方法的利弊。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
枸橼酸芬太尼		在体		芬太尼混合液：麻醉混合液； 腹腔注射剂量：0.0125 ml/g 终末混合液浓度：0.05 mg/kg
盐酸美托咪定		内部		芬太尼混合液：麻醉混合液； 腹腔注射剂量：0.0125 ml/g 最终混合液浓度：0.05 mg/kg
盐酸咪达唑仑		在体		芬太尼混合液：麻醉混合液； 腹腔注射剂量：0.0125 ml/g 终末混合液浓度：0.05 mg/kg
2,2,2-三溴–乙醇				Avertin 鸡尾酒：麻醉剂； 腹腔注射剂量：0.0075 cc/g 最终混合液浓度：1%
2-甲基-2-丁醇（终浓度：0.775%）				Avertin 鸡尾酒：麻醉剂； IP剂量：0.0075 cc/g 最终混合液浓度：0.775%
TC-1000 小鼠温度控制系统		CWE, Inc.	TC-1000 小鼠	体温调节
Toberadex		在体		眼药膏
10% 氯化铁		Ricca Chemical Company	3120-32	薄颅骨制备
显微外科刀片		Sable Industries	S-6400	薄颅骨制备
氰基丙烯酸酯 404,401		Loctite	P/N 46551	薄颅骨制备
氰基丙烯酸酯 401		Loctite	P/N 40140	薄颅骨制备
Zip Kicker 胶水加速剂		Pacer Technology	PT-29	薄颅骨制备
微型钻头钢制磨头 0.7 mm 尖端直径		Fine Science Tools	19008-07	薄颅骨制备
Microtorque 控制盒和 Tech2000 手柄		Ram Products, Inc.	TECH2000开/关	薄颅骨制备
#6-0（0.7 公制）丝线缝合线		Ethicon Inc.	K8894H	锥形 C-1
眼科敷料镊，10 cm，尖端宽度0.5 mm，弯曲	手术工具	Fine Science Tools	11152-10
超精细邦剪，8.5 厘米，直头，刃口长度 13 毫米	手术工具	Fine Science Tools	14084-08
标准型直头镊子，2.5 mm × 1.35 mm 尖端，12 cm	手术工具	Fine Science Tools	11000-12