使用磨薄颅骨制备法对小鼠视觉皮层进行长期成像

摘要

在本视频及补充材料中，我们展示了一种利用磨薄颅骨制备法对完整大脑进行长期在体成像的实验方案。

摘要

体内成像利用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）可实现对完整大脑中活细胞和神经元过程的研究。本文介绍的技术能够以显微分辨率对同一脑区在多个时间点进行成像（慢性成像），从而追踪树突棘——这些微小结构代表了中枢神经系统中大多数兴奋性突触后位点。在多个时间点清晰分辨精细皮层结构的能力具有诸多优势，尤其在脑可塑性研究中，突触形态变化与神经环路重塑可能有助于揭示其潜在机制。在本视频及补充材料中，我们展示了一种利用磨薄颅骨制备方法进行完整脑组织慢性体内成像的实验方案。磨薄颅骨制备是一种微创方法，可避免对硬脑膜和/或皮层造成潜在损伤，从而减少炎症反应的发生。当该方案正确执行时，可在较长时间内清晰地监测完整脑组织中树突棘特征的变化。

方案

1. 为了利用双光子显微镜观察完整脑组织中的神经元，需制备神经元标记有荧光标记物的样本。在本实验中，我们使用GFP-M转基因小鼠品系，该品系可标记第5层锥体细胞。¹5层锥体细胞将树突突起投射到浅层，从而可观察到最深达 300 μm 软脑膜水平以下。另一种方法是使用病毒标记物对细胞进行标记（参见 Lowery 等，已提交至JOVE。
2. 使用70%乙醇对工作区进行消毒，并将器械高压灭菌以用于无菌手术。用干净的敷料覆盖操作台面。
3. 使用芬太尼混合物（芬太尼 0.05 mg/kg；咪达唑仑 5 mg/kg；美托咪定 0.5 mg/kg）对小鼠进行麻醉，随后按照 IACUC 批准的操作程序给予四分之一剂量的 Avertin（0.0075 mg/ml）。麻醉前通过皮下注射（SQ）给予镇痛剂丁丙诺啡（0.5 mg/kg）进行预处理。通过尾部或脚趾夹捏反应监测麻醉深度。
4. 维持动物于 37.5°C 使用带有直肠温度计的加热毯。
5. 涂抹眼膏以防止眼睛干涩。手术期间用小片纸张遮盖眼睛，以保护眼睛免受光源照射。
6. 使用剪刀从耳后至眼睛处去除头部背面的毛发。
7. 用70%乙醇依次擦拭动物头部表面，随后用碘伏擦洗剂和碘伏溶液进行清洁。
8. 在耳后做一L形切口，沿中线右侧或左侧（根据将要成像的半球而定）延伸至眼睛。将皮肤向外翻折，远离手术区域。不要去除皮肤，因为皮肤将在成像结束后进行缝合。
9. 使用精细镊子轻轻将皮肤从目标区域向上提起并拉开。
10. 用洁净的镊子或显微手术刀轻轻刮除颅骨暴露区域的骨膜。使用棉签将少量10%三氯化铁涂抹于颅骨表面，彻底干燥骨膜膜并确保其完全去除。确保颅骨完全干燥，以保证胶水的良好黏附（见步骤11）。用镊子或显微手术刀轻轻刮除已干燥的骨膜膜。
11. 在不锈钢头板的成像窗口周围涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水（见图1），并将头板固定在颅骨上。
12. 使用棉签棒的木端将胶水涂抹于成像窗口的内侧接缝处，确保填充成像板与颅骨曲面之间的所有间隙。
13. 在窗口处滴加一滴胶水加速剂。用棉签或无尘纸迅速擦去多余的胶水加速剂。钻孔前，胶水必须完全固化。
14. 使用装有0.7 mm不锈钢钻头的牙科钻头，在成像窗口处开始磨薄颅骨。钻磨过程中交替使用0.9%无菌生理盐水，以避免颅骨产生过多热量。
15. 使用牙科钻在颅骨表面以小幅度往复动作打磨出一个 4x4 mm 的窗口。用钝头镊子测试颅骨的薄度，轻微施压时颅骨表面应略有凹陷。成像的最佳颅骨厚度在 10 至 30 μm.
16. 当颅骨变薄且成像窗口清理干净所有碎屑后，在颅骨上滴加生理盐水。使用安装在解剖显微镜上的数码相机拍摄成像窗口的照片。拍摄照片并利用脑血管结构有助于确定后续成像过程中成像板的放置位置。
17. 将动物转运至双光子成像装置。在整个成像过程中，动物应始终保持在加热毯上（并使用直肠探针监测体温）。注意：在麻醉状态下，若未使用加热装置，动物的核心体温将出现显著波动，可能导致皮层损伤甚至死亡。
18. 使用配备Mai Tai激光器、10 W固态泵浦源以实现最大输出功率以及改装的Olympus Fluoview共聚焦单元的双光子显微镜。该系统针对深层组织成像进行了优化，并将外置探测器尽可能靠近物镜安装，以最大限度地检测来自脑组织的荧光信号。采用Olympus LUMPlan fl/IR 20×/0.95 NA物镜。成像过程中使用0.9%生理盐水浸没物镜。
19. 使用该显微镜，并设置低数字变焦（x1），找到含有强荧光标记神经元的区域。
20. 使用固定在显微镜目镜上的数码相机拍摄成像区域的照片，或手绘血管分布图。此步骤对于在后续时间点重新定位至相同的成像位置至关重要。
21. 获取低倍图像序列（20倍物镜，512×512像素； 5 μm 步骤）贯穿整个脑部的可见范围（通常跨越约 ~200 μm) 显示树突分支的程度。注意：此低倍图像将用于在后续时间点定位成像区域，因为在幼年和成年动物中，血管和树突的结构均保持稳定。
22. 使用成像软件（Fluoview，v. 5.0，FV300）将数字放大倍数提高8倍。如有必要，调整X、Y坐标（平移坐标），并采集高倍率图像堆栈，以显示包括树突棘位置和结构在内的详细树突形态。记录每次堆栈采集的详细笔记，例如平移坐标、采集范围、Z轴步进大小以及堆栈中的步数。这些记录将在后续时间点重新定位至该树突或轴突时使用。
23. 成像完成后，轻轻将头板从颅骨表面分离并取下。使用镊子清除颅骨上残留的胶水，并用0.9%无菌生理盐水擦拭颅骨表面。用6号缝合线将颅骨上的皮肤缝合。用70%乙醇擦拭手术区域。为缓解术后恢复期间的疼痛，皮下注射0.1 mg/kg的布托啡诺镇痛剂。
24. 将动物置于干净的笼子中，并在加热灯下保温，直至其苏醒并能自主活动。随后将动物放回原笼中。
25. 如需在后续时间点对动物进行重新成像（我们的成像时间点间隔可从2天至数月不等），请使用上述无菌方法拆除缝线或重新切开头部皮肤。利用首次手术时获取的脑血管数字图像，定位原始成像位置。重新固定不锈钢头固定板（步骤10–12）。使用显微外科刀片轻轻削除在两次成像时间点之间可能再生的骨组织；如有必要，可使用牙科钻进行减薄。清除成像窗口的碎屑，并滴加一滴0.9%无菌生理盐水。
26. 将动物转移至双光子显微镜并定位原始成像区域。可参考首次成像时拍摄的数字照片以辅助定位。
27. 打开 Fluoview 程序并载入原始低倍图像。将透明薄膜固定在计算机屏幕上，使用透明度笔勾画主要血管的分布模式。
28. 打开实时图像，并将血流血管与透明胶片上的示意图重新对齐。
29. 要重新成像8倍放大后的结构，请打开前次成像会话中采集的目标图像序列。将该结构（即轴突、树突、胶质细胞等）勾画在贴附于电脑屏幕上的透明薄膜上。
30. 将实时图像放大8倍，并将平移坐标设置为第一天成像的参数。根据低倍镜下定位的准确性，可能需要轻微调整图像的角度。找到目标结构后，将其与手绘的高倍镜图像模式进行比对。以相同的步进间距和相同的z层图像数量采集z轴层扫数据，用于后续分析。
31. 重复步骤29和30，直至重新采集完所有高倍镜图像。
32. 成像完成后，重复步骤22-24。可最多在2个不同的时间点进行重复成像。
33. 动物实验严格按照罗切斯特大学医学与牙科学院动物实验中心和实验动物医学科制定的指南和规定进行，完全符合国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证要求，并遵守州法律、联邦法规及美国国立卫生研究院（NIH）政策。

代表性结果

在表达GFP-M的小鼠中，使用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）可轻松观察到部分第5层锥体细胞及其相应的树突结构¹。本文展示了一种磨薄颅骨的制备方法，即在目标成像区域的颅骨被磨薄至约10–30 μm。若操作得当，本方案可使我们在完整视觉皮层中清晰地观察树突和树突棘，用于急性或慢性分析（图2）。

图1. 定制的头部固定板和基板。 （A）用于减薄颅骨手术准备的定制头部固定板和基板的顶视图。（B）定制头部固定板和基板的侧视图。（C,D）头部固定板的详细示意图和图像。

图2. 经薄颅骨制备后使用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）获得的代表性结果。 (A) 成像的树突 体内 使用双光子显微镜对转基因GFP-M小鼠视觉皮层进行成像。图像为每隔一定时间获取的单幅图像的投影 5 μm 从软脑膜至最终深度 175 μmA图中的方框区域代表在第0天（D0）和四天后（D4）成像的B和C图放大区域。（D, E）B和C图中方框内树突分支的高倍放大图像，显示稳定的树突棘（白色箭头）、消失/回缩的树突棘（红色箭头）和新生的树突棘（绿色箭头）。比例尺＝A。 200 μmB，C。 20 μm，D,E。 5 μm.

讨论

利用双光子显微镜进行慢性成像正成为研究可塑性过程中所触发的形态学变化的一种日益流行的技术^2-5。本文中，我们展示了一种减薄颅骨的制备方法，用于在不同成像日对完整小鼠脑内的特定树突棘进行追踪。在此方案中，颅骨保持完整，对皮层造成的损伤极小，从而引起极低水平的神经炎症，避免可能对脑功能产生干扰⁶。该方法允许动物在首次手术后立即进行成像，并可在数天至数年后重复成像。这是一种强大的技术，但也存在其局限性。相比之下，更为侵入性的开窗制备方法需进行颅骨切除术，因而会伴随胶质细胞的激活，但可在颅骨窗口保持清晰期间，实现任意次数的重复脑成像。而减薄颅骨制备方法由于涉及小鼠皮肤的切开与缝合手术，最多仅限于三次成像。此外，颅骨开窗法在成像深度穿透方面更具优势²。因此，在决定慢性成像实验的手术方案时，应仔细权衡各种方法的利弊。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
枸橼酸芬太尼		在体		芬太尼混合液：麻醉混合液； 腹腔注射剂量：0.0125 ml/g 终末混合液浓度：0.05 mg/kg
盐酸美托咪定		内部		芬太尼混合液：麻醉混合液； 腹腔注射剂量：0.0125 ml/g 最终混合液浓度：0.05 mg/kg
盐酸咪达唑仑		在体		芬太尼混合液：麻醉混合液； 腹腔注射剂量：0.0125 ml/g 终末混合液浓度：0.05 mg/kg
2,2,2-三溴–乙醇				Avertin 鸡尾酒：麻醉剂； 腹腔注射剂量：0.0075 cc/g 最终混合液浓度：1%
2-甲基-2-丁醇（终浓度：0.775%）				Avertin 鸡尾酒：麻醉剂； IP剂量：0.0075 cc/g 最终混合液浓度：0.775%
TC-1000 小鼠温度控制系统		CWE, Inc.	TC-1000 小鼠	体温调节
Toberadex		在体		眼药膏
10% 氯化铁		Ricca Chemical Company	3120-32	薄颅骨制备
显微外科刀片		Sable Industries	S-6400	薄颅骨制备
氰基丙烯酸酯 404,401		Loctite	P/N 46551	薄颅骨制备
氰基丙烯酸酯 401		Loctite	P/N 40140	薄颅骨制备
Zip Kicker 胶水加速剂		Pacer Technology	PT-29	薄颅骨制备
微型钻头钢制磨头 0.7 mm 尖端直径		Fine Science Tools	19008-07	薄颅骨制备
Microtorque 控制盒和 Tech2000 手柄		Ram Products, Inc.	TECH2000开/关	薄颅骨制备
#6-0（0.7 公制）丝线缝合线		Ethicon Inc.	K8894H	锥形 C-1
眼科敷料镊，10 cm，尖端宽度0.5 mm，弯曲	手术工具	Fine Science Tools	11152-10
超精细邦剪，8.5 厘米，直头，刃口长度 13 毫米	手术工具	Fine Science Tools	14084-08
标准型直头镊子，2.5 mm × 1.35 mm 尖端，12 cm	手术工具	Fine Science Tools	11000-12