本文介绍了IP-FCM方法，该方法无需基因工程或大量样本，即可对天然蛋白质-蛋白质相互作用进行灵敏、稳健的生化分析。
本文内容
摘要
摘要
流式细胞术检测免疫沉淀（IP-FCM）是一种高效检测和定量蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该方法的基本原理延伸自夹心ELISA，即被捕获的目标蛋白可与其在多蛋白复合物中物理结合的其他分子一同被检测。该操作流程包括：将针对目标蛋白的免疫沉淀单克隆抗体（mAb）共价偶联到聚苯乙烯乳胶微珠上，将这些微珠与细胞裂解液孵育，使用荧光染料标记的探针检测被捕获的蛋白复合物，并通过流式细胞术分析微珠相关的荧光信号。IP-FCM具有极高的灵敏度，允许分析蛋白质的天然（非变性）状态，适用于半定量或定量分析。此外，IP-FCM无需基因工程操作或除流式细胞仪以外的特殊设备，且易于扩展用于高通量应用。
方案
**本视频实验方案基于一篇相关出版物1： 通过流式细胞术实现对天然蛋白质-蛋白质相互作用及多蛋白复合物的高灵敏度检测与定量分析。Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang W. A. Schamel, Ed Palmer. Science's STKE 2007 (389): pl2, 2007年6月5日，[DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]。请点击此处查看该出版物。
开始前，请准备以下水溶液储备液：
| MES 偶联缓冲液： | 储存于 25°C |
| MES, pH 6.0 | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| 淬灭/封闭/储存（QBS）缓冲液： | 储存于 4°C |
| BSA | 1% |
| 叠氮化钠 | 0.02% |
| PBS, pH 7.4 | 1x |
| FCM 缓冲液： | 储存于 4°C |
| Tris, pH 7.4 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| 叠氮化钠 | 0.02% |
| FBS | 5% |
| PBS, pH 7.4 | 1x |
使用前立即配制：
| EDAC-MES： | 将 EDAC 粉末溶解于 MES 偶联缓冲液中，配制成 50 mg/mL 的溶液 |
| Digitonin 溶液（2% w/v）： | 将 digitonin 粉末溶于 dH2O 中，95°C 加热 5 分钟，然后置于冰上冷却 |
| 裂解缓冲液： | |
| Tris, pH 7.4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Digitonin 溶液 | 1% |
| 蛋白酶抑制剂 | 1× |
| 置于冰上保存 |
1. 单克隆抗体与磁珠的偶联
- 通过将购买的磁珠原液用 PBS 稀释，并使用血细胞计数板进行计数，确定其浓度。计数时可先进行 1:10000 的稀释。
- 用移液器将 18 × 106 个磁珠转移至 1.5 mL 微离心管中。
- 用 0.5 至 1.0 mL MES 偶联缓冲液洗涤磁珠 2 至 3 次，每次洗涤后在 25°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。
- 将磁珠重悬于 50 μL MES 偶联缓冲液中。
- 加入 20 μL 新鲜配制的 EDAC-MES 溶液，以活化磁珠表面的羧基基团。
- 在 25°C 下轻轻混匀 15 分钟，通过手动反复吹打实现混合。
- 用 0.5 至 1.0 mL PBS 洗涤活化后的磁珠 2 至 3 次，每次洗涤后在 25°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。
- 将活化后的磁珠重悬于 50 μL PBS 中。
- 向活化磁珠溶液中加入 50 μL IP 用单克隆抗体（储存浓度为 0.2–1.0 mg/mL）。
- 将离心管置于振荡摇床中，在 25°C 下混合 3 至 4 小时，振荡速度应足够防止磁珠在管底沉积。
- 用 0.5 至 1.0 mL PBS 洗涤抗体偶联磁珠 2 至 3 次，每次洗涤后在 25°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。
- 将磁珠重悬于 100 μL QBS 缓冲液中。此悬液可在 4°C 下保存。
- 充分重悬磁珠后，用 PBS 稀释 1:200 至 1:10,000，使用血细胞计数板进行计数。每批制备的磁珠均需测定浓度，以便精确控制每次免疫沉淀或拉下实验中所使用的磁珠数量。
2. 核上清裂解液的制备与免疫沉淀
裂解方法和最佳裂解条件取决于所研究的细胞类型和蛋白质-蛋白质相互作用。已有多种方案可供选择，并可根据具体应用进行调整。
- 在1.5 mL微量离心管中，将20 × 106 个“小”细胞（如淋巴细胞）或5 × 106 个“大”细胞（如巨噬细胞或肿瘤细胞）加入100 μL新鲜裂解缓冲液中，冰上裂解20分钟。根据需要调整裂解液体积。
- 为去除细胞核及不溶性细胞碎片，将裂解液在4°C下以20,000g离心10分钟。保留上清液，弃去沉淀。
- 向澄清的裂解液中加入0.5 × 105 至2.5 × 105 个抗体偶联磁珠，轻轻吹打混匀。单次免疫沉淀（IP）所用的最小体积为5 μL。
- 置于4°C冷藏室内的垂直旋转仪上，旋转4小时至过夜。设置适当的转速以防止磁珠沉降。低体积免疫沉淀反应中液体停留在管底是可接受的。
3. 使用荧光染料标记抗体检测磁珠捕获的蛋白质
- 用 0.2 至 1.0 mL 冰冷的 FCM 缓冲液清洗 IP 磁珠两次，每次清洗后在 4°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。
- 将磁珠重悬于 100 μL FCM 缓冲液中，并将 20 μL 分装至五个或更多 1.5-mL 微量离心管或烟囱底板的孔中。
- 向样品中加入荧光染料偶联的单克隆抗体。根据试剂供应商的说明或经验确定的浓度进行 FCM 染色。作为起始参考，每管或每孔加入 0.2 至 1 μL 原液抗体溶液（浓度为 0.2–1.0 mg/mL），冰上孵育 40 分钟。
- 对于 1.5-mL 离心管中的染色磁珠，用 1.0 mL 冰冷的 FCM 缓冲液清洗两次，每次清洗后在 4°C 下以 20,000g 离心 3 分钟。每次离心后小心吸除上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。对于烟囱底板，每次使用 0.2 mL 冰冷的 FCM 缓冲液清洗，每次清洗后在 4°C 下以 1000g 离心 5 分钟。此步骤可使用多通道移液器操作。从烟囱底板的孔中去除上清液时，可将板快速甩动一次，然后在保持倒置状态下，用吸水纸轻拍孔边缘以吸去残留液滴。每个孔中残留的体积（含磁珠）约为 20 μL。
- 将每份样品的磁珠重悬于 200 μL FCM 缓冲液中，转移至已标记的 FACS 管中。样品现可进行流式细胞术分析。
4. 流式细胞术数据采集
本方案中描述的CML磁珠直径为3至5 μm，约为静息小鼠淋巴细胞直径的一半。因此，可能需要手动增加前向散射（FSC）放大增益和侧向散射（SSC）电压，以使磁珠事件群落在图谱上正常显示。单个免疫沉淀磁珠应形成一个紧密聚集的单一细胞群。应调整仪器设置和设门范围，以排除磁珠双联体和碎片。
- 在运行微珠或微珠标准品之前，移除某些流式细胞仪样品入口周围用于防止液滴飞溅的套管。在样品之间让鞘液滴出，以清洗入口，防止微珠从一个样品携带到下一个样品中。
- 使用未标记微珠作为荧光阴性对照，以及彩虹校准微粒（Rainbow Calibration Particles, RCPs）作为荧光阳性对照，调整仪器设置，使阴性和阳性荧光信号的极端值同时显示在对数尺度的x轴上。这可确保实验样品的荧光信号也处于量程范围内。注意RCPs比CML微珠小，因此可能需要临时调整FSC和SSC参数以及设门位置以适应该样品。
- 完成RCPs校准后，恢复至未标记微珠的设置。若每个样品仅使用一种荧光探针，则无需进行荧光补偿。通常情况下，我们对每个流式细胞术（FCM）样品使用单一荧光素标记的单克隆抗体来检测多蛋白复合物，并通过平行染色多个微珠样品，分别使用针对不同亚基的特异性单克隆抗体，来分析多个相互作用组分。
- 采集并保存荧光数据文件。随后可使用CellQuest、FlowJo或CFlow等流式细胞术分析软件进行数据分析。
5. 代表性结果
图1. TCR/CD3多蛋白复合物的免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）分析。 来自BALB/c小鼠品系的T细胞在1%皂苷中裂解，裂解液使用抗CD3ε磁珠进行IP-FCM分析。捕获的复合物中含有大量TCR-β（紫色区域）以及共结合的CD3-ε（绿色），而其他蛋白如Thy1.2、CD45或H-2K(d)的信号接近背景水平（由无关免疫球蛋白探针定义，粉色曲线；分别为棕色、橙色和蓝色曲线）。参见此前发表的类似结果1-6。
讨论
蛋白质相互作用的信息对于分析多种细胞过程（如信号转导、谱系成熟、细胞周期进程和凋亡级联反应）具有重要意义。免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）提供了一种快速、定量且灵敏的方法，用于检测蛋白质间的相互作用，并鉴定多蛋白复合物中的成员，且可在其天然构象下进行分析。实验中可将微珠与细胞裂解液在一天内完成偶联和孵育，次日即可进行探针检测与分析。采用96孔板格式可实现高通量样本的同时检测，从而高效收集用于统计分析或筛选的数据。通过使用荧光微珠标准品，可估算每个微珠捕获的蛋白质分子数量。该方法对起始样本量需求极低，因此即使来源有限的样本或低丰度分析物也可用于多种相互作用的研究。尽管IP-FCM无需基因工程、表位标记、变性或 体外 在非生理环境中混合蛋白质时，可将其与这些及其他技术联用，使其成为一种适用于多种生物系统的有价值且易于使用的工具。
故障排除：
许多免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）实验在首次尝试时即可产生有价值的蛋白质相互作用数据。然而，优化IP-FCM可改善抗体与微珠的偶联、蛋白质复合物的捕获以及荧光探针的结合。
IP 抗体偶联的效率可通过直接使用抗免疫球蛋白抗体检测偶联后的磁珠来确定。如果偶联效率较低，可在偶联反应中提高抗体浓度，从而使更多的 IP 抗体结合到每个磁珠上。这可以增加 IP 磁珠批次的结合能力，进而增强对分析物的捕获和检测。偶联反应过程中不应存在其他含伯胺的分子（例如 Tris、牛血清白蛋白），因为这些分子会与单克隆抗体（mAb）竞争磁珠表面的结合位点，导致 mAb 偶联效率降低。如果由于其他原因导致 mAb 与磁珠的偶联困难，可改用将磁珠与亲和素（avidin）或链霉亲和素（streptavidin）偶联，随后使用生物素标记的抗体通过非共价结合的方式进行免疫沉淀。
尽管抗体偶联效果良好，但最初检测到的微珠相关荧光信号可能较低。首先，复合物的捕获效率本身可能较低。由于免疫沉淀-流式细胞术（IP-FCM）依赖于分析物的浓度，增加每单位裂解体积所裂解的细胞数量可提高分析物的捕获和检测水平。此外，通过减少与裂解液共同孵育的免疫沉淀微珠数量，可使捕获的复合物分布在更少的微珠上，从而在探针检测时提高每个微珠的平均荧光强度。其次，可能存在免疫沉淀抗体在空间位阻上阻碍探针抗体接近已捕获复合物的情况。此时，可通过更换不同的抗体用于捕获和/或检测来解决该问题。
致谢
本研究由老鹰创新奖（Fraternal Order of Eagles）和梅奥基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 羧基修饰的聚苯乙烯胶乳（CML）微珠（5mm 无表面活性剂） | 试剂 | Interfacial Dynamics | 2-5000 | 4°C 保存。 |
| 彩虹校准微粒 | 试剂 | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | 4°C 保存。 |
| 2-[N-吗啉代]乙磺酸（MES） | 试剂 | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDAC） | 试剂 | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | -20°C 干燥条件下保存。 |
| 蛋白酶抑制剂通用混合液，含 AEBSF、Bestatin、Aprotinin、EDTA、E-64 和 Leupeptin | 试剂 | Sigma-Aldrich | P-2714 | 用 H2O 配制 100 倍储存液。分装后于 -20°C 保存。操作时佩戴手套。 |
| PCR 板，96 孔，0.2 mL，无色，高壁 | 试剂 | Fisher Scientific | 08-408-230 | 用于流式细胞术染色过程中替代微量离心管 |
参考文献
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
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