假性骨折：一种急性外周组织创伤模型

摘要

假性骨折是一种可重复的小鼠无菌性肌肉骨骼创伤模型，可用于评估创伤后晚期的免疫反应。本文逐步描述了该模型的操作流程，包括通过实验模型组合的可能性，以实现对多发性创伤的研究。

摘要

创伤后，机体早期会出现过度活跃的炎症反应，可能导致多器官功能障碍，并使创伤患者的死亡率升高；这种反应常伴随延迟性免疫抑制，增加感染相关的临床并发症，也可能进一步提高死亡率。^1-9 目前已有许多研究开始评估创伤后免疫系统反应性的这些变化。^10-15
免疫学研究得益于多种可用于体内建模的转基因和基因敲除小鼠，这些品系有助于深入探究参与免疫反应的分子通路。^16-21

在实验性小鼠创伤建模中，长期研究存在较大挑战，因为小鼠骨折固定技术较为复杂且难以重复。^22-30

这种假性骨折模型是一种易于复制的创伤模型，通过免疫学方式模拟肢体骨折环境，克服了上述困难，同时允许动物自由活动，并在无需持续、长期使用麻醉剂的情况下实现长期存活。该模型旨在重现长骨骨折的特征；在不破坏原有骨骼的前提下，使受损的肌肉和软组织暴露于受损的骨骼和骨髓环境中。

假性骨折模型包括两个部分：首先对后肢进行双侧肌肉挤压损伤，随后将骨溶液注射到这些受损的肌肉中。骨溶液的制备方法是从年龄和体重相匹配的同系供体后肢中取出长骨，将这些骨骼碾碎后重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，从而制成骨溶液。

双侧股骨骨折是一种常用的、成熟的肢体创伤模型，在假骨折模型的开发过程中被用作对照模型。在多种可选的骨折模型中，我们选择采用伴有软组织损伤的闭合性骨折方法作为与假骨折相对照的模型，因为我们希望采用一种无菌但外周组织创伤程度相对严重的模型。³¹

在严重创伤情况下，失血性休克是一种常见表现，而全身性低灌注为创伤模型增加了非常重要的因素。^32-36 假性骨折模型可轻松与失血性休克模型结合，构建出高严重程度的多重创伤模型。³⁷

方案

1. 仪器和手术区域准备：

所有实验操作均需采用无菌技术进行。开始实验前，实验区域必须彻底清洁并灭菌。实验台面应先消毒，待其自然风干后，再用70%酒精擦拭。在实验工作区域内放置外科蓝色垫巾和无菌敷料巾。

所有材料和仪器在使用前均需高压灭菌。注射器和针头已预先灭菌，可直接使用。研究人员应正确穿戴实验服、外科口罩和无菌外科手套。

我们的手术器械每天晚上均通过高压灭菌器进行灭菌。手术后使用抗菌肥皂和水清洗器械，然后将其放置在洁净的手术蓝色垫上自然晾干。待干燥后，小心地将器械放入灭菌袋中，并进行灭菌以备后续使用。

打开热珠灭菌器，确保其温度升至适宜范围——300–350°F，然后方可开始实验。该灭菌器将在对各小鼠进行实验操作期间用于器械的清洁。取一个不锈钢器械托盘，加入70%乙醇至其容积的1/3处，乙醇量应足以浸没所有手术器械。打开循环加热垫，在其上放置外科蓝色垫巾，再在其上方覆盖无菌手术敷料。该加热装置用于在实验操作及恢复期间维持小鼠的适宜体温。将所有无菌器械、纱布、注射器、针头以及一个1.5 mL离心管放置于无菌敷料上。开启无菌器械及其他物品时需格外小心，避免用手接触造成污染。建议在进行此准备操作时佩戴无菌手套。

2. 假性骨折模型 - 实验步骤：

1. 麻醉小鼠的诱导及体位摆放。

首先，给予小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（70 mg/kg）。操作时，先用手指捏住小鼠尾根部将其从笼中提起。随后需称量小鼠体重，以计算正确的麻醉剂剂量。接着，在仍握住其尾巴的同时，将动物放置于笼盖顶部。用拇指和中指分别抓住小鼠前肢后方颈部两侧的皮肤，食指用于向后牵拉头颈部皮肤并部分固定头部。小指与无名指夹住小鼠尾巴，同时用无名指按压小鼠脊柱的腰椎区域。麻醉作用通常在约5分钟内完全起效，应通过反射测试确认麻醉效果。

动物失去意识后，将其仰卧位放置在有机玻璃板上，并使用松散环形胶带技术固定其四肢。松散环形技术仅需裁剪细长胶带条，将每条胶带松松地缠绕在四肢远端部位，然后将胶带自身粘合，多余部分固定于板上。该方法可确保实验操作的一致性，同时使小鼠四肢保持更自然的姿势。随后使用Oster A5剃毛器（40号刀头）剃除动物腹部、腹股沟及大腿区域的毛发，以利于维持无菌区域。取一块4×4纱布浸透聚维酮碘溶液，擦拭手术区域进行消毒。再将无菌敷料折叠后覆盖于小鼠身体上，仅暴露其下肢和头部。

固定并消毒后，在开始实验操作前，将含有异氟烷的鼻罩置于小鼠鼻部数秒钟。鼻罩由一个50 mL锥形管构成，管内填充纱布。锥形管底部一端的一半被切除，形成可供小鼠鼻部插入的空间。一个盖子（如组织储存容器的底部，即直边广口瓶盖）被套在锥形管的切口端，以便在不使用时确保异氟烷蒸气保留在管内。应在锥形管内的纱布上加入1 mL异氟烷。使用麻醉剂时，尤其是通过鼻罩使用异氟烷时，必须密切观察小鼠的状态。当动物的呼吸开始变慢时，即可开始实验，此时应移除并封闭鼻罩。

如果在实验过程中需要追加麻醉，可注射额外的戊巴比妥钠或给予异氟烷。异氟烷给药的替代方法是可选的，最新指南建议在可行的情况下使用精密挥发器，以实现对麻醉更佳的控制。然而，无论采用上述哪种方法，都必须密切监测小鼠的呼吸生理状态。

2. 假性骨折实验。

假性骨折是将软组织损伤与向受损肌肉注射骨溶液相结合的方法，需在后肢双侧进行。在对受体小鼠进行任何实验操作之前，必须预先配制好骨溶液。

3. 骨组织溶液的制备。

一只供体小鼠制备的骨组织溶液足以用于三只受体小鼠。供体小鼠应为与受体实验小鼠年龄和体重相匹配的同系小鼠。

将通过吸入异氟烷对供体小鼠实施安乐死。随后，将供体小鼠固定于有机玻璃板上，需特别注意仅在足尖处用胶带固定下肢。下肢需仔细剃毛，并彻底涂抹聚维酮碘，再用酒精擦拭以确保无菌。接着，以无菌操作方式从双侧下肢完整取出股骨和胫骨。为取出下肢的长骨，首先在腹股沟区域的皮肤做手术切口，并沿下肢全长向下至踝关节方向继续切开皮肤。将皮肤牵开，从皮下筋膜和肌肉（包括内侧和外侧）分离，以获得最大暴露视野。将剪刀的一侧刀片插入位于胫骨前方和外侧的肌肉（胫前肌、趾长伸肌、拇长伸肌、腓骨长肌、腓骨短肌）下方，上下滑动刀片，将肌肉完整剥离于下方骨骼。在胫骨后方和内侧下方重复此操作，以分离位于胫骨下方的肌肉（腓肠肌、比目鱼肌、跖肌、胫后肌、趾长屈肌、拇长屈肌）。当向远端滑动时，后侧操作应施加最小额外力度，以便将腓骨从胫骨上折断分离。在这些腿部肌肉的近端，尽可能靠近其附着点处切断肌腱，并将肌肉向远端牵拉；同时整体向下轻拉肌群，轻微牵扯即可使这些肌肉的远端附着点从踝关节释放。可用剪刀直接剪断踝关节。此时切勿将胫骨与股骨分离！此连接可提供额外杠杆作用，有助于从髋关节解剖出股骨。对股骨上的肌肉可采用类似技术进行剥离，必要时也需在后方以及内侧和外侧进行操作。切断这些肌群的远端附着点，使其从膝关节释放。继续解剖，于肌肉下方深入分离，将股骨近端从髋关节中完整取出。为便于解剖操作，皮肤切口应根据需要延长，以获得充分暴露。在解剖过程中，可通过活动髋关节处的股骨来帮助定位其近端位置。

将股骨（附带胫骨）从供体小鼠取出后，将其置于无菌的4×4纱布上。通过分别用两只手握住两根骨头，并沿其长轴向相反方向轻轻扭转/旋转，即可在膝关节处分离这两根骨头。建议对这两根骨头进行轻柔的解剖和操作，因为过度的手动操作容易导致骨折。为去除长骨上残留的肌腱附着物，可使用一块干燥无菌的4×4纱布包裹住骨的全长，将纱布紧贴骨面，并多次从头至尾完整地拉过整根骨头，这样可将残余组织从骨表面刮下，组织会黏附在纱布上并被迅速而轻松地移除。收集到的骨头应直接放入无菌的1.5 mL微量离心管中，并置于冰上以用于运输。

这四块供体骨将被送至生物安全柜中，用于制备骨溶液。使用前必须彻底消毒生物安全柜，并在柜内工作区域铺上无菌敷料。将无菌研钵和研杵、无菌8 mL离心管以及无菌磷酸盐缓冲液（PBS）放置于工作区域内。生物安全柜内还应备有1 mL移液器及相应的吸头。

应使用无菌镊子以无菌操作方式将收获的骨骼从1.5 mL离心管中取出，并放入研钵中；随后用研杵轻轻研磨骨骼。磷酸盐缓冲液（PBS）用于重悬骨碎片以供注射。用移液器吸取1 mL PBS加入研钵中，继续研磨剩余碎片，并辅以额外的环形研磨动作，以确保充分重悬。然后加入另外1 mL PBS，继续研磨以制备“骨溶液”。溶液应呈现淡粉色，研钵底部会残留少量无法完全粉碎的颗粒。将溶液缓慢从研钵中倒入8 mL离心管中，以收集最大体积的液体，同时确保较大的残留物留在研钵内。该骨溶液在实验使用前应始终置于冰上，并在注射前转移至1 mL注射器中。随后将一根20号针头连接至装有骨溶液的1 mL注射器，用于向小鼠给药。选择这种大规格针头是为了确保所有骨碎片在注射时都能进入目标区域，而不会堵塞针头。

在注射到受体小鼠之前，取一滴骨溶液接种于麦康凯琼脂平板进行培养（培养24-48小时），以确保骨溶液的无菌性。同时必须检测骨溶液的pH值，确保其为中性pH。

4. 软组织损伤。

这种软组织损伤为双侧后肢挤压伤。将小鼠初始体位摆成后肢轻度外展并外旋，有助于准确定位目标肌群，即膝关节屈肌（股二头肌、半腱肌和半膜肌）。使用一把18厘米长的止血钳实施挤压损伤。通过Sensor Products公司生产的Topaq压力分析系统检测，该止血钳施加的压力分布为270 psi。止血钳应夹住股骨后侧大腿肌肉，位置位于股骨中点，其凸面朝向股骨。止血钳仅需闭合至第一档锁定位置，并保持30秒。必须仔细注意止血钳的放置位置——切勿夹在股骨上，以避免造成骨折。每次操作均应保持一致，以确保在不同小鼠之间产生可重复的损伤。该挤压损伤需在双侧下肢同时进行。

5. 骨组织溶液注射。

受体实验小鼠将按先前所述方法进行麻醉和准备，并在骨注射前已接受软组织损伤处理。

随后将骨细胞悬液双侧注射到受体小鼠压碎的股部肌肉中。使用20号针头，将0.15 mL该悬液注射至每侧大腿的后侧肌肉。进针时穿透皮肤约2~3 mm，并注意控制进针深度——当针尖斜面刚好触碰到股骨时会有所感觉，此位置最为理想。此时注射骨细胞悬液。拔出针头后，立即用无菌手套包裹的手指按压注射部位，防止骨细胞悬液从伤口反流。保持按压数秒钟。

当麻醉作用减弱后，应立即将小鼠放回笼中，使其完全自由活动。小鼠苏醒时必须给予适当镇痛处理。

6. 术后/恢复期。

移除松散的环形胶带，将动物放入清洁的笼子中，并将笼子置于循环加热垫上，术后恢复期间保持数小时。如有需要，应额外使用加热灯以确保适宜的温度。

食物和水将随时供应。
动物从麻醉状态开始苏醒时必须给予镇痛剂，以正确控制疼痛。当动物开始出现身体活动时，应皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg），但不得过早注射，以免影响呼吸功能。

在麻醉期间，应持续监测小鼠，直至其从麻醉中恢复或达到实验终点。术后也应密切观察小鼠，必要时给予额外的镇痛药物。应监测动物的活动能力、呼吸状况、摄食和饮水情况，若出现任何痛苦迹象（如呼吸困难、疼痛、饮食习惯改变等），应及时处理。

将手术器械放入70%酒精中，用无菌纱布擦拭，然后置于玻璃珠灭菌器中，每只动物之间灭菌约20秒。取出手术器械后，喷洒70%酒精以助冷却，并将其放置于无菌敷料区域。确保器械上无残留酒精，以免滴入下一只动物体内。

3. 比较性双侧股骨骨折模型 - 实验步骤：

将对实验小鼠进行麻醉，并按最初所述方法进行准备。应使用一个较大的18 cm止血钳，在膝关节上方约2-3 mm处夹住后肢，止血钳的凸面朝向膝关节。将拇指放在夹紧的止血钳顶部，食指置于止血钳与髋部之间。在扭转之前务必触摸到股骨，以明确骨折位置。然后逆时针扭转止血钳，同时另一只手顺时针扭转。
对对侧后肢重复此操作。

4. 多发伤模型——假性骨折联合出血性休克的实验操作步骤：

受体小鼠将被麻醉并进行初始处理，如前所述。需要接受失血性休克联合假骨折处理的小鼠，将在假骨折手术前进行股动脉插管，待假骨折操作完成后，通过该导管进行放血以建立休克模型。

5. 成功的秘诀：

常规：

• 务必额外注意，尽可能保持无菌操作。
• 在麻醉给药过程中，尤其是通过鼻罩给予异氟烷时，应密切监测小鼠的整体生理状况，包括呼吸频率。

骨组织溶液的制备：

• 轻柔操作骨骼——过度用力可能导致骨骼在简单手动操作过程中轻易骨折！
• 解剖时应确保将腓骨从胫骨上完全分离。
• 开始时应先轻轻研磨骨骼——以确保所有骨碎片均保留在研钵内！
• 最初仅加入 1 mL PBS，继续研磨剩余的骨碎片；待形成良好悬液后，再加入剩余的 1 mL PBS。
• 仅收集研钵和研杵中的液体部分——避免收集未能完全破碎的较大组织碎片，这些碎片可能在注射到受体小鼠时堵塞或卡在针头中。

软组织损伤：

• 止血钳的放置位置至关重要——不可夹在股骨上，否则会导致骨折。应将止血钳夹在正确的肌肉组织上（后侧大腿屈膝肌群），以确保损伤的可重复性。

骨组织溶液注射：

• 注射溶液时，注意针头插入的深度——当针尖斜面刚好接触到股骨时会有所感觉，此位置最为理想。
• 拔出针头后，迅速用手指按压注射部位，防止骨溶液从伤口反流。手指按压持续数秒。

6. 术后注意事项：

• 检查腿部是否存在感染。
• 检查骨组织溶液培养情况。
• 动物可能因实验操作及伴随的炎症反应而出现后肢使用困难，应妥善管理疼痛。

讨论

假性骨折是一种可重复的小鼠无菌性肌肉骨骼创伤模型，可用于评估创伤后的免疫反应。该假性骨折模型通过模拟长骨骨折的特征，在免疫学上重现了肢体骨折的环境：受损的肌肉和软组织暴露于损伤的骨组织和骨髓，但不破坏原有的骨骼结构^38,39。在假性骨折创伤后可观察到一种双相免疫反应，其特征是早期出现高炎症反应，并在6小时达到峰值；随后进入第二阶段，表现为延迟性免疫抑制，在约48小时处呈现低谷。该模型有助于克服某些实验性小鼠创伤建模中的挑战，例如复杂的骨折固定操作，且难以重复。特别是，该模型允许动物在不发生原生骨骨折的情况下长期存活，因而适用于对创伤后免疫反应进行晚期阶段的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术用蓝色垫单	Fisher Scientific	50-7105
无菌敷料	Fisher Scientific	NC9517505
循环加热垫 18"x26"	Harvard Apparatus	py872-5272
热珠灭菌器	VWR 国际公司	11156-002
不锈钢托盘 8" ×11"	VWR 国际公司	62687-049
有机玻璃板（10×15×0.5 cm）	匹兹堡大学机械加工车间
胶带卷 1"	企业快递	MMM26001
50毫升锥形管	任何供应商
直边广口瓶（用作鼻锥的盖子）	VWR 国际公司	159000-058
Oster A5 电动剪毛器，配40号刀头	VWR 国际公司	10749-020
手术剪（直型） – 12 cm	Fine Science Tools	14068-12
止血钳，弯型，18 cm	Harvard Apparatus	81331718
镊子（0.8 mm 尖端，弯曲型，10 cm）	Fine Science Tools	11050-10
纱布 4"x4"	任何供应商
1.5 cc 微型离心管	任何供应商
冰桶	任何供应商
研钵和研杵	Fisher Scientific	12-961AA
1毫升注射器配25G针头	Fisher Scientific	14-826-88
20G针头	任何供应商
1 mL 移液器	任何供应商
1 mL 移液器吸头	任何供应商
Falcon 聚苯乙烯 8 ml 管	VWR 国际	60819-331
灭菌袋 3"x8"	VWR 国际公司	24008
灭菌袋 5"x10"	VWR 国际公司	24010
MacConkey II 琼脂平板	BD 生物科学	221172
乙醇 - 200 proof	Pharmco-AAPER		[70%]
戊巴比妥钠（Nembutol 钠溶液）	OVATION Pharmaceuticals		70 mg/kg
异氟烷（Isoflurane）	Baxter Internationl Inc.		99.9%
聚维酮碘（贝塔碘）	三件式一次性用品
磷酸盐缓冲液（PBS）
盐酸丁丙诺啡	贝德福德实验室		0.1 mg/kg