宿主细胞因子在卡波西肉瘤（KS）的发生和维持过程中起着关键作用。我们概述了鉴定在KSHV感染的DMVEC细胞及KS肿瘤组织中发生改变的宿主细胞因子的方法。病毒所改变的细胞基因可作为新型治疗手段的潜在靶点。
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摘要
摘要
目前，卡波西肉瘤（KS）是非洲南部地区最 prevalent 的与艾滋病相关的恶性肿瘤，因此也是全球范围内最 prevalent 的此类肿瘤。1,2 它被定义为血管内皮细胞的血管增殖性肿瘤，并以胸腔积液淋巴瘤（PEL）和某些类型的多中心型Castleman病的形式产生罕见的B细胞淋巴增殖性疾病。3-5 卡波西肉瘤（KS）病灶中仅有1-5%的细胞能够主动支持与KS相关的卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的裂解复制，显然，在肿瘤发生及肿瘤进展过程中，细胞因子必须与病毒因子相互作用。6,7 鉴定促进卡波西肉瘤病理过程的新型宿主因子对于开发用于肿瘤进展和转移的预后标志物，以及研发治疗卡波西肉瘤的新型疗法至关重要。8 配套视频详细介绍了我们在卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染后的皮肤微血管内皮细胞（DMVEC）以及卡波西肉瘤（KS）肿瘤组织中，鉴定宿主细胞基因表达程序变化所采用的方法。9 通过微阵列分析鉴定出表达失调的基因后，利用免疫印迹和双标记免疫荧光法验证蛋白表达的变化。表达失调基因的转录水平变化也得到确认 体外 通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行验证。 体外 使用存档的卡波西肉瘤肿瘤组织，通过双标记免疫组织化学和组织微阵列进行研究。8,10 我们鉴定卡波西肉瘤肿瘤组织微环境中失调基因的方法将有助于开发 体外 随后 体内 用于发现和评估卡波西肉瘤新型潜在治疗手段的模型系统
方案
1. KSVH 培养与 DMVEC 感染
- BCBL-1 细胞系最初分离自人体体腔淋巴瘤，使用完全 RPMI 1640 培养基（Gibco，Grand Island，NY）进行培养。BCBL-1 细胞从液氮中取出后，置于干冰上运输，并在 1 分钟内快速解冻 37°CA 50 μL BCBL-1 细胞悬液，密度为 1×10⁶ 个/mL4 细胞/mL 加入含10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素的500 mL RPMI 1640培养基中，并分装至175 cm²培养瓶中，每瓶50 mL。
- BCBL-1细胞的培养瓶随后在37°C、5% CO₂培养箱中孵育。 37°C 在5% CO的环境中2 直至细胞密度达到 3x106 cells/mL。通过加入 20 ng/mL TPA 和 0.3 ng/mL 丁酸钠诱导裂解周期病毒复制。
- 诱导24小时后，用40 mL pH 7.4的PBS缓冲液在Sorvall Legend RT离心机中以1500 rpm离心洗涤细胞两次（以去除丁酸盐），随后在RPMI 1640培养基中加入20 ng/mL TPA继续诱导5天。
- 通过差速离心法分离并浓缩无细胞病毒。简言之，首先在Sorvall RC-6 Plus离心机中以10,000 rpm转速离心去除细胞及细胞碎片，将其沉淀下来。 4°C 30分钟。移除含有病毒的上清液，并在Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机中将无细胞病毒沉淀 4°C 25,000 rpm 下离心 1 小时。
- 去除无病毒的上清液，将病毒沉淀重悬于冻存液（10% 二甲基亚砜和 90% 胎牛血清）中，并于 -80 °C 保存80°C 直到需要时为止。
原代DMVEC细胞的KSHV感染。 - 传代次数为2-5代的DMVEC细胞以初始密度1 × 10⁵ 接种5 在100 mm × 20 mm组织培养皿或腔室载玻片中培养，并在完全EMB-2培养基（Lonza，巴塞尔，瑞士）中维持培养，置于 37°C 在5% CO的环境中2当细胞融合度达到80%时，以感染复数（moi）0.01感染DMVEC；对照组细胞采用模拟感染（仅加入培养基）。每2天为细胞更换新鲜培养基。
- 每日观察 DMVEC 细胞单层及腔室载玻片，以检查是否存在感染迹象，感染表现为梭形细胞形成。一旦发现梭形细胞形成的首个迹象（7–14 天），即停止更换培养基。然而，若培养时间超过 15–21 天且未补充新鲜培养基，可能损害 DMVEC 细胞的完整性，导致细胞死亡或从培养皿脱落。
- 在感染过程中纺锤化达到最大程度时，收集细胞单层以制备细胞沉淀，用于蛋白质或RNA提取。将感染的DMVEC细胞培养 chamber slides 用预热的pH 7.4 PBS缓冲液以1 mL/窗的用量洗涤两次。在用pH 7.4 PBS洗涤两次后，收获chamber slides上的细胞。待其完全干燥后，移除chamber，将玻片置于盛有-20°C保存的100%甲醇的容器中。20°C 待进行免疫荧光染色（IFA）时取出使用。
2. 模拟感染与KSHV感染DMVEC细胞中总RNA的提取及cDNA的制备
- 使用Qiagen RNesay Mini KIT（Qiagen, Valencia, CA）从KSHV感染的DMVEC细胞和模拟感染的细胞中提取总RNA。若以培养细胞为RNA提取来源，则采用试剂盒说明书附录中提供的动物组织处理方案，但省去匀质化步骤。
- 根据说明书附录中的制造商建议，选择在柱上使用Qiagen DNAse I无DNA酶试剂盒对RNA进行DNAse I处理。DNAse I可降解RNA制备过程中可能污染的基因组或病毒DNA。该DNAse I处理步骤对后续应用（包括RT-PCR、qRT-PCR和微阵列分析）至关重要。
- 按照说明书进行RNA洗涤，并比制造商建议的次数多进行一次离心，以彻底去除洗涤缓冲液中的残留乙醇。残留乙醇会影响洗脱后RNA的纯度。
- 在最后一次洗涤后，在从柱子上洗脱RNA之前，额外进行一次离心步骤。使用30 μL无RNA酶的水从柱子上洗脱RNA。随后在Eppendorf AG-6131 Bio-Photometer上对RNA进行定量并分析其纯度。其光密度比值（260/280 nm）应在1.8–2.0之间，这是高纯度RNA的典型范围。
- 对于微阵列分析，使用Agilent 2100 Bioanalyzer并结合RIN软件算法对RNA进行分析。该分析可提供1–10之间的RNA完整性数值（RIN），但研究表明RIN值在7–10范围内的RNA可为微阵列或qRT-PCR分析提供一致且更可靠的结果。我们实验室使用Qiagen RNAeasy试剂盒提取的RNA平均RIN值范围为7.5–9。
- 通过将1 μL洗脱的RNA加入99 μL的10 mM Tris-EDTA（pH 7.6）中实现RNA定量。将RNA与缓冲液用移液器混合后，加入洁净的比色皿中，使用Eppendorf Bio-Photometer进行分光光度分析。
- 在进行逆转录之前，使用制造商提供的随机六聚体对每份样品中的一微克mRNA进行引物启动。
cDNA合成 - 为从总RNA合成单链cDNA，我们使用Applied Biosystems的High-Capacity cDNA逆转录试剂盒，并按照制造商说明书操作。
- 配制2x试剂预混液，将10 μL体积中含有0.5至1 μg RNA的样品加入10 μL的2x预混试剂中。将所得的1x溶液轻轻混匀，并按照制造商说明书在BIORAD MJ Mini-thermal cycler中进行逆转录反应。
- 每个20 μL反应体系最多可使用两微克总RNA。cDNA在Eppendorf AG-6131 Bio-Photometer上于260 nm处定量，并在-80°C保存，直至用于qRT-PCR。
3. 模拟感染与KSHV感染DMVEC细胞的微阵列比较分析
我们的实验室在范德堡大学医学中心微阵列共享资源核心设施以收费服务的方式进行微阵列分析。我们将KSHV感染的DMVEC细胞中基因转录失调的输出文件与模拟感染的对照细胞进行比较。对KSHV感染细胞中与血管生成、细胞增殖相关或代表转移性生物标志物的转录失调基因进行验证。 体外 使用KSHV感染的DMVEC细胞，通过实时PCR、Western印迹和双重IFA进行检测，并将结果与存档的KS肿瘤组织中的发现进行比较。
4. 假感染和KSHV感染DMVEC中发现的差异表达基因的定量Rt-pcr转录分析
- 使用 Sorenson Bioscience, Inc. 的 96 孔光学板和 MyiQ 单色实时 PCR 检测系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA），以 25 μL 反应体积进行实时 PCR，cDNA 来源于纯化的 RNA 样本并通过逆转录酶生成。该操作在生物安全柜中进行，以避免可能存在于环境中的外源 DNA/cDNA 污染。
- 根据制造商说明书，在 1.5 mL 离心管中为每对引物配制主混合液，使用 SYBR Green Supermix（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）以及针对各目标基因的特异性正向和反向引物，终浓度为每孔 250 nM，用无 RNA 酶和 DNA 酶的 H2O 配制。每个样本需设三个重复。
- 用于宿主细胞基因的 qRT-PCR 引物序列包括 KSHV LANA 的引物序列，LANA 是卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏期相关核抗原，在 KSHV 感染的 DMVEC 细胞和卡波西肉瘤（KS）组织中高表达。
- 将模拟感染和 KSHV 感染 DMVEC 细胞来源的 10 ng/μL cDNA 原液用无 RNA 酶和 DNA 酶的 H2O 按 1:3 比例稀释；每孔加入 3 μL 稀释液。对照孔以水替代 cDNA。
- 用光学封膜（Bio-Rad Laboratories）密封 96 孔板，轻轻混匀后于室温下以 1000 rpm 离心 2 分钟，使反应液沉至孔底。此时开启 Bio-Rad MyiQ 检测系统及其光源，预热 10 分钟后再开始运行程序。
- 将离心后的 96 孔板放入 Bio-Rad MyiQ 单色实时 PCR 检测系统，输入并保存循环程序，启动运行。
- 循环程序如下：95°C 预变性 3 分钟，随后进行 81 个循环：95°C 变性 15 秒，60°C 退火 1 分钟，95°C 读板 1 分钟，55°C 退火 1 分钟，55°C 延伸 30 秒。程序中包含熔解曲线分析，用于检测引物扩增效率。同时扩增 GAPDH 引物组作为归一化对照。
- 数据分析使用 Bio-Rad iQ5 光学系统软件 Version 2 完成。
5. KSHV 感染的 DMVEC 细胞的双标记免疫荧光分析
- 将含有融合生长的感染与未感染DMVEC的腔室载玻片（从腔室中取出）用pH 7.4的PBS洗涤两次，风干，并在-20°C预冷的无水甲醇中固定10分钟，随后保存于-20°C。
- 将带有细胞的载玻片风干15分钟，然后放入盛有Tris盐溶液（0.05 M Tris，pH 7.4）并置于冰上的Coplin染色缸中，孵育5分钟。随后，细胞在湿盒中于37°C孵育1小时，加入单克隆抗体混合物，用于检测KSHV LANA，抗体稀释比例为1:50（溶于pH 7.4 PBS，购自Vector Laboratories, Burlingame, CA），同时加入针对宿主因子蛋白的山羊多克隆抗体（1:100稀释于pH 7.4 PBS），该宿主因子蛋白经微阵列分析在KSHV感染的DMVEC细胞中表达失调。
- 细胞随后用Tris盐溶液洗涤3次（切勿让细胞干燥），然后加入二抗混合物，在PBS中稀释1:100，包括与罗丹明红-X偶联的驴抗小鼠IgG抗体和与FITC偶联的驴抗山羊抗体（均购自Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA），共同孵育30分钟。
- 细胞随后在Coplin染色缸中用Tris盐溶液洗涤3次，载玻片仍保持湿润时，使用含1.5 g/mL DAPI的Vectashield封片剂（Vector Laboratories, Burlingame, CA）封片，并加盖盖玻片。
- 在Nikon TE 2000S荧光显微镜（配备电荷耦合器件（CCD）相机）下观察荧光信号并拍摄图像。使用20倍物镜拍摄，总放大倍数为200倍。
- 在相同放大倍数（200倍）下，分别使用UV照明，配合绿色滤光片观察罗丹明荧光，蓝色滤光片观察FITC荧光，拍摄独立图像。随后使用Nikon的免费软件将图像合并。
6. 针对KSHV LANA和内皮细胞标志物PECAM-1/CD31的KS组织及KS组织芯片的双标记免疫组织化学
- 使用DAKO链霉亲和素ABC双染试剂盒对KSHV LANA以及病毒感染后表达发生改变的宿主细胞蛋白进行双重标记免疫组织化学染色。免疫组织化学染色在经福尔马林固定、石蜡包埋的艾滋病相关卡波西肉瘤（AIDS-KS）组织存档样本上进行。
- 使用切片机切割出5微米厚的组织切片，并将其置于Chemate载玻片上，以备免疫染色使用。
- 将石蜡包埋的切片在通风橱中用二甲苯脱蜡10分钟，随后依次用100%、95%和70%梯度乙醇各水化5分钟。然后将切片置于水中10分钟，进行抗原修复（也称为抗原去遮蔽）。
- 免疫染色过程中，抗原修复在微波炉中使用50 mM、pH 6.0的柠檬酸缓冲液于95°C下进行15分钟。简而言之，将载有细胞的切片浸入95°C的柠檬酸缓冲液中15分钟，随后立即转移至室温蒸馏水中。
- 通过将切片在淬灭液中孵育30分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。具体操作：在50 mL锥形管中加入47 mL 95%乙醇，再加入11.2 mL pH 7.4的PBS和1.8 mL 3%过氧化氢，总体积为60 mL。
淬灭液需现用现配。 - 随后将细胞在pH 7.4的PBS中室温洗涤3次，每次5分钟。配制封闭液（12.5 mL 95%乙醇、1.4 mL正常山羊血清、140 mg牛血清白蛋白和2滴Tween 20）以防止抗体非特异性结合。使用前将封闭液置于冰上。（该封闭液可在4°C保存，最多保存1周）。
- 将封闭液加至载玻片上的样本，覆盖一条石蜡条（防止样本干燥），放入湿盒中，室温孵育1小时。
- 将针对病毒抗原的一抗（单克隆或多克隆抗体）用封闭液按1:50比例稀释，用移液器混匀后置于冰上备用。每张组织样本需50–100 μL抗体溶液，具体用量取决于样本大小和载玻片数量。
- 封闭孵育结束后，轻轻摇去封闭液，向组织样本中加入50–100 μL一抗溶液，并覆盖一条石蜡条。样本在湿盒中室温孵育1–2小时。
- 将载有样本的切片在pH 7.4的PBS中洗涤3次，每次5分钟。然后加入用PBS pH 7.4按1:100稀释的生物素化山羊抗小鼠二抗，于湿盒中室温孵育30–45分钟。
- 在使用前约30分钟，配制PBS pH 7.4中的辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素溶液。使用DAKO Cytomation Duet试剂盒，将50 μL溶液A加入5 mL PBS pH 7.4中，涡旋混匀，再加入50 μL溶液B并再次混匀。
- 完成第6.10步的抗体孵育后，将切片在PBS pH 7.4中洗涤3次，随后加入新配制的辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素溶液，在湿盒中室温孵育30–45分钟。
- 孵育结束后，将切片在室温下用PBS pH 7.4洗涤3次。在最后一次洗涤结束前5分钟，配制3,3-二氨基联苯胺（DAB，SIGMA）底物溶液（20 mL PBS pH 7.4、25 μL 3%过氧化氢和1片DAB片剂）。待DAB片剂完全溶解后，用0.45微米注射器滤器过滤呈棕褐色的溶液。最后一次洗涤完成后，立即将过滤后的DAB溶液加入样本中，并在Nikon Eclipse E200显微镜下通过明场照明实时观察感染细胞中KSHV LANA的显色情况。当达到理想显色程度后，将样本在蒸馏水中孵育5分钟以终止反应。
- 对于双重标记IHC，在水中孵育后，将载有样本的切片重新从抗原修复步骤（6.4）开始进行第二次免疫组织化学染色。但在过氧化物酶底物步骤（6.11）中，不再使用辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素，而是采用碱性磷酸酶偶联链霉亲和素。
- 通过上述微波辅助的额外抗原修复步骤，以及使用针对表达失调细胞蛋白的单克隆抗体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）进行第二次免疫染色，实现第二次标记。细胞随后被洗涤，并与生物素化山羊抗小鼠/兔IgG抗体（DAKO）在1:100稀释度下孵育，接着与碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物（Vector Labs, Burlingame, CA）在1:500稀释度下孵育。使用Vector Red碱性磷酸酶底物试剂盒（Vector Laboratories, Burlingame, CA）按照制造商说明加入Vector Red底物进行显色。如需复染，可使用orecin或苏木精。最后使用Permout封片剂和盖玻片对组织样本进行永久封片，并在配备CCD相机的Nikon TE-2000S显微镜下通过明场照明采集图像。
7. 通过腺病毒转导 DMVEC 细胞进行基因递送
- 将正常 DMVEC 细胞以每孔 2.5 × 105 个细胞的密度接种于培养板小室中，使用 EBM-2 完全培养基进行培养。
- DMVEC 细胞培养至 80% 融合度（需 3–5 天）后，每孔加入 5 µL 含腺病毒的液滴，该腺病毒表达 EGFP，滴度为 1 × 1010 粒子/mL。
- 在加入病毒 18 小时后，观察含腺病毒的活 DMVEC 细胞培养物中 EGFP 的荧光表达情况。
- 使用配备 CCD 相机的 NIKON TE 2000S 荧光显微镜，在总放大倍数 200× 下拍摄明场与荧光图像，并进行图像合并。
8. 代表性结果
图1. 来自Lonza Corporation的原代DMVEC细胞在EBM-2培养基中培养，并以0.01的感染复数（moi）接种BCBL-1病毒。 感染后，每天观察DMVEC细胞单层。感染后第10天，模拟感染的细胞呈现鹅卵石样形态，而KSHV感染的细胞则表现出梭形细胞形态，该形态特征与卡波西肉瘤（KS）肿瘤组织中受KSHV感染的内皮细胞所见的梭形细胞一致。照片使用配备CCD相机的NIKON TE 2000S显微镜在总放大倍数100倍下拍摄。
图 2. 对感染 KSHV 的 DMVEC 细胞在感染后第 10 天进行双重标记的间接免疫荧光染色。 感染细胞使用针对 KSHV LANA 的单克隆抗体和针对 KSHV 感染后发生改变的特定宿主细胞蛋白的山羊多克隆抗体进行双重染色。加入与罗丹明和 FITC 偶联的驴抗小鼠和驴抗山羊二抗混合物。使用配备 CCD 相机的 Nikon TE2000S 荧光显微镜观察细胞。使用含 DAPI 的封片介质以显示细胞核。所有照片的总放大倍数均为 200 倍。表达病毒 LANA 蛋白（罗丹明染色）并定位于细胞核的感染细胞，其细胞质中特定宿主细胞蛋白的表达水平降低（FITC 染色）。
图3. KS肿瘤组织中LANA和PECAM-1/CD31的免疫组织化学染色。 艾滋病相关卡波西肉瘤（AIDS KS）肿瘤组织采用单标记和双标记免疫组织化学（IHC）方法对KSHV LANA和PECAM-1/CD31进行染色。A) 显示使用抗LANA单克隆抗体染色的KS组织，并以苏木精复染。白色箭头指示LANA阳性细胞。B) 显示使用抗PECAM-1/CD31单克隆抗体染色的KS组织，染色特异性定位于血管周围的内皮细胞，白色箭头所示。C) 显示同一组织切片中对LANA（Vector Red染色，黑色箭头指示）和CD31（棕色染色，白色箭头指示）进行双标记染色的结果。D) 显示与C图同一张切片中另一区域的较低倍镜视野。明场图像采用NIKON TE2000S显微镜拍摄，A-C图总放大倍数为600×，D图为200×。
图4. 感染后10天通过qRT-PCR检测KSHV LANA的时间表达，与模拟感染的对照细胞比较。 所有KSHV感染的DMVEC细胞的数值均以GAPDH为内参进行标准化。在模拟感染的细胞中未检测到LANA cDNA的扩增。
图 5. 卡波西肉瘤（KS）肿瘤组织芯片。 该组织芯片（TMA）在一张载玻片上排列了直径为 0.6 毫米的组织芯。每个组织芯代表来自不同患者的 KS 肿瘤标本。TMA 由俄亥俄州立大学 Leona Ayers 博士提供的艾滋病癌症标本资源库（ASCR）提供。将石蜡包埋的 KS 肿瘤组织以及配对的正常组织和阳性对照组织置于玻璃载玻片上。KS 肿瘤标本取自口腔、皮肤、软腭、舌部及颈部肿块。所有患者均为 HIV 阳性。
图6. 采用免疫组织化学法对组织微阵列进行KSHV LANA染色，并通过明场显微镜进行分析。 LANA染色使用DAB作为过氧化物酶底物进行显色，LANA阳性细胞呈现明显的棕褐色染色模式。可观察到不同水平的病毒载量及梭形细胞区域。A）代表肿瘤特定区域内局灶性病毒感染。B）代表播散性感染，病毒载量较高，大致与存在的梭形细胞数量相关。染色的组织芯在200倍放大倍数下进行观察。
图7. 在EBM-2完全培养基中以每孔2.5 × 105 个细胞的密度培养的DMVEC细胞，用5 μL滴度为1.0 × 1010 的腺病毒进行转导。 转导后18小时检测EGFP荧光表达。使用尼康TE 2000S显微镜在总放大倍数200倍下拍摄相差图像和荧光图像。原代DMVEC细胞的转染已被证明存在困难，因此我们筛选出可高效递送fibulin-2和galectin-3的病毒载体。我们发现表达EGFP的腺病毒可高效转导原代DMVEC细胞。此外，我们还发现从Lentigen Corporation获得的慢病毒载体在转导原代DMVEC细胞方面同样高效（数据未显示）。
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讨论
本报告中使用的方法可在多种实验室环境中进行，但需要一些特殊设备或核心设施的使用权。进行涉及传染性病毒病原体（如KSHV）的实验时，必须采取适当的预防措施，此类实验可能需要在生物安全三级（BSL-3）设施中操作。组织样本的获取还必须获得相应机构审查委员会（IRBs）的批准。
这些方法共同为鉴定表达失调的基因提供了基础 体外 并提供明确的方法 体内 验证内皮细胞中基因表达谱的改变以及基因递送策略。综合这些发现可能有助于阐明受KSHV感染以及特定病毒基因影响的生物化学通路。了解卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）等致癌病毒如何干扰特定分子通路，可为新型治疗手段的开发提供重要线索。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢梅哈里医学院的 James E.K. Hildreth 对本手稿提出的建议和审阅。我们还感谢 Diana Marver 对手稿的编辑工作。本研究得到了梅哈里范德比尔特艾滋病研究中心（NIH 资助号 P30 AI054999-05）、艾滋病健康差异研究中心（NIH 资助号 5U54 RR019192-05）、梅哈里临床研究中心（NIH 资助号 P20RR011792）以及 NIH 资助号 P01 CA113239 的支持。D.J.A 部分经费来自范德比尔特-梅哈里艾滋病研究中心（CFAR）和梅哈里临床研究中心（CRC）的试点资助项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 培养基 | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits 补充剂 |
| DMVEC 细胞 (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30066.03 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| 腔室载玻片 | Nalge Nunc International | 154461 | |
| KSHV LANA 单克隆抗体 | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 稀释/IFA |
| 半乳糖凝集素-3 山羊多克隆抗体 | R&D Systems | AF1154 | |
| 驴抗山羊 FITC 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| 驴抗山羊 Rho 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 稀释/IFA |
| 封片剂 | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield 含 DAPI |
| BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 161-0112 | |
| 驴抗山羊偶联抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western 显色底物 | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| 生物素标记的兔抗山羊抗体 | Dako | 305-065-045 | |
| AP-链霉亲和素偶联物 | Dako | K 0492 (试剂盒) | |
| 无 RNase 和 DNase 的试剂套装 | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler 扩增仪 | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer 分光光度计 | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus 离心机 | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K 超速离心机 | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S 荧光显微镜 | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer 生物分析仪 | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 显微镜 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT 离心机 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
参考文献
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- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
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