宿主细胞因子在卡波西肉瘤（KS）的发生和维持过程中起着关键作用。我们概述了鉴定在KSHV感染的DMVEC细胞及KS肿瘤组织中发生改变的宿主细胞因子的方法。病毒所改变的细胞基因可作为新型治疗手段的潜在靶点。
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摘要
摘要
目前，卡波西肉瘤（KS）是非洲南部地区最 prevalent 的与艾滋病相关的恶性肿瘤，因此也是全球范围内最 prevalent 的此类肿瘤。1,2 它被定义为血管内皮细胞的血管增殖性肿瘤，并以胸腔积液淋巴瘤（PEL）和某些类型的多中心型Castleman病的形式产生罕见的B细胞淋巴增殖性疾病。3-5 卡波西肉瘤（KS）病灶中仅有1-5%的细胞能够主动支持与KS相关的卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的裂解复制，显然，在肿瘤发生及肿瘤进展过程中，细胞因子必须与病毒因子相互作用。6,7 鉴定促进卡波西肉瘤病理过程的新型宿主因子对于开发用于肿瘤进展和转移的预后标志物，以及研发治疗卡波西肉瘤的新型疗法至关重要。8 配套视频详细介绍了我们在卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染后的皮肤微血管内皮细胞（DMVEC）以及卡波西肉瘤（KS）肿瘤组织中，鉴定宿主细胞基因表达程序变化所采用的方法。9 通过微阵列分析鉴定出表达失调的基因后，利用免疫印迹和双标记免疫荧光法验证蛋白表达的变化。表达失调基因的转录水平变化也得到确认 体外 通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行验证。 体外 使用存档的卡波西肉瘤肿瘤组织，通过双标记免疫组织化学和组织微阵列进行研究。8,10 我们鉴定卡波西肉瘤肿瘤组织微环境中失调基因的方法将有助于开发 体外 随后 体内 用于发现和评估卡波西肉瘤新型潜在治疗手段的模型系统
方案
1. KSVH 培养与 DMVEC 感染
- BCBL-1 细胞系最初分离自人体体腔淋巴瘤，使用完全 RPMI 1640 培养基（Gibco，Grand Island，NY）进行培养。BCBL-1 细胞从液氮中取出后，置于干冰上运输，并在 1 分钟内快速解冻 37°CA 50 μL BCBL-1 细胞悬液，密度为 1×10⁶ 个/mL4 细胞/mL 加入含10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素的500 mL RPMI 1640培养基中，并分装至175 cm²培养瓶中，每瓶50 mL。
- BCBL-1细胞的培养瓶随后在37°C、5% CO₂培养箱中孵育。 37°C 在5% CO的环境中2 直至细胞密度达到 3x106 cells/mL。通过加入 20 ng/mL TPA 和 0.3 ng/mL 丁酸钠诱导裂解周期病毒复制。
- 诱导24小时后，用40 mL pH 7.4的PBS缓冲液在Sorvall Legend RT离心机中以1500 rpm离心洗涤细胞两次（以去除丁酸盐），随后在RPMI 1640培养基中加入20 ng/mL TPA继续诱导5天。
- 通过差速离心法分离并浓缩无细胞病毒。简言之，首先在Sorvall RC-6 Plus离心机中以10,000 rpm转速离心去除细胞及细胞碎片，将其沉淀下来。 4°C 30分钟。移除含有病毒的上清液，并在Beckman Coulter....
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讨论
本报告中使用的方法可在多种实验室环境中进行，但需要一些特殊设备或核心设施的使用权。进行涉及传染性病毒病原体（如KSHV）的实验时，必须采取适当的预防措施，此类实验可能需要在生物安全三级（BSL-3）设施中操作。组织样本的获取还必须获得相应机构审查委员会（IRBs）的批准。
这些方法共同为鉴定表达失调的基因提供了基础 体外 并提供明确的方法 体内 验证内皮细胞中基因表达谱的改变以及基因递送策略。综合这些发现可能有助于阐明受KSHV感染以及特定病毒基因影响的生物化学通路。了解卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）等致癌病毒如何干扰特定分子通路，可为新型治疗手段的开发提供重要线索。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢梅哈里医学院的 James E.K. Hildreth 对本手稿提出的建议和审阅。我们还感谢 Diana Marver 对手稿的编辑工作。本研究得到了梅哈里范德比尔特艾滋病研究中心（NIH 资助号 P30 AI054999-05）、艾滋病健康差异研究中心（NIH 资助号 5U54 RR019192-05）、梅哈里临床研究中心（NIH 资助号 P20RR011792）以及 NIH 资助号 P01 CA113239 的支持。D.J.A 部分经费来自范德比尔特-梅哈里艾滋病研究中心（CFAR）和梅哈里临床研究中心（CRC）的试点资助项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 培养基 | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits 补充剂 |
| DMVEC 细胞 (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30066.03 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| 腔室载玻片 | Nalge Nunc International | 154461 | |
| KSHV LANA 单克隆抗体 | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 稀释/IFA |
| 半乳糖凝集素-3 山羊多克隆抗体 | R&D Systems | AF1154 | |
| 驴抗山羊 FITC 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| 驴抗山羊 Rho 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 稀释/IFA |
| 封片剂 | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield 含 DAPI |
| BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 161-0112 | |
| 驴抗山羊偶联抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western 显色底物 | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| 生物素标记的兔抗山羊抗体 | Dako | 305-065-045 | |
| AP-链霉亲和素偶联物 | Dako | K 0492 (试剂盒) | |
| 无 RNase 和 DNase 的试剂套装 | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler 扩增仪 | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer 分光光度计 | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus 离心机 | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K 超速离心机 | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S 荧光显微镜 | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer 生物分析仪 | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 显微镜 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT 离心机 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
参考文献
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J.....
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