为了研究眼蝶属（Bicyclus anynana）蛹期翅组织中的基因表达，我们提供了一种使用核糖探针进行原位杂交的优化实验方案。同时，我们还提供了该方案的进一步优化指南，以便将其应用于其他鳞翅目物种的蛹期翅组织。
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摘要
摘要
本文以视频形式展示了利用核糖探针在蝴蝶Bicyclus anynana蛹翅中进行原位杂交的实验方案。原位杂交是发育生物学中的常用技术，可用于在转录水平研究发育组织中基因表达的空间和时间模式。当尚未开发出针对基因转录产物蛋白的特异性抗体，或基因组中存在多个高度同源的基因拷贝而现有抗体无法区分时，原位杂交可作为替代方法。尽管针对幼虫翅盘的原位杂交技术已在蝴蝶研究领域应用多年，但本方案已针对更大且更脆弱的蛹翅组织进行了优化。
方案
第1天
- 配制以下溶液：
- 10× PBS
- 1× PBS
- 1× PBT
- ddH2O
- 加入 DEPC 至终浓度为 0.1%，并剧烈振荡溶液。
- 高压灭菌。
- 4% 多聚甲醛固定液 — 使用 PBS-DEPC 配制
- 蛋白酶 K 溶液 — 若出现沉淀，取样前需剧烈涡旋混匀
- 消化终止缓冲液
- 预杂交缓冲液
- 50:50 PBT:预杂交缓冲液
- 杂交缓冲液
- 所有溶液应保持无 RNase 状态。使用经烘烤处理（250°C 烘烤 4 小时）的玻璃器皿或一次性塑料器皿。血清移液管在配制溶液时非常有用
- 在 PBS 中解剖特定发育时间点的蛹翅
- 将翅组织直接转移至 24 孔培养板的孔中，加入固定缓冲液，于室温下进行固定
- 固定组织 2 小时
- 用 PBT 洗涤 5 次，每次 5 分钟
- 将翅组织在蛋白酶 K 溶液中孵育 3 分钟
- 用消化终止缓冲液冲洗 2 次
- 用 PBT 洗涤 5 次，每次 5 分钟
- 用 50:50 PBT : PHB 洗涤 2 次，每次 5 分钟
- 用 PHB 洗涤 1 次，持续 10 分钟
- 在 55°C 下于 PHB 中孵育至少 1 小时
- 热变性 RNA 探针（每孔需 20–50 ng，80°C 处理 5 分钟），然后加入杂交缓冲液（每孔需 100 μl）
- 将探针加入各孔中，在 55°C 下孵育 48 小时
第3天
- 用 PHB 在 55°C 下洗涤 4 次，每次 5 分钟
- 在 55°C 的 PHB 中孵育过夜
第4天
- 配制以下溶液：
- 抗体封闭缓冲液
- 在 50:50 PBT : PHB 中洗涤 1 次，每次 5 分钟
- 在 PBT 中洗涤 4 次，每次 5 分钟
- 将翅在封闭缓冲液中 4°C 孵育 1 小时
- 将翅在 1:2000 稀释的抗-Dig 抗体溶液中 4°C 过夜孵育
第5天
- 准备以下溶液：
- 检测缓冲液
- 显色液——避光（用铝箔包裹）
- 在室温下用 PBT 洗涤 3 次，每次 5 分钟
- 用 PBT 洗涤 7 次，每次 5 分钟
- 用检测缓冲液冲洗翅片 2 次
- 在 1 ml 显色液中显色——每次显色时间必须密切监测，即使使用相同的探针和显色液，显色时间也可能发生变化——通常在 5–10 分钟后开始检查，随后延长间隔，最长可过夜。未观察样品时，应将培养板用铝箔包裹以避免光照。
- 用终止显色缓冲液冲洗 5 次
- 封片保存翅片。
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讨论
现有方案的优化
已成功利用来自Precis coenia蝴蝶的幼虫翅盘进行原位杂交实验（Carroll等，1994；Keys等，1999；Weatherbee等，1999）。本实验方案改编自Carroll实验室提供的详细书面方案，该方案可应要求获取，用于幼虫翅染色。我们所做的修改旨在适应幼虫与蛹期翅组织之间的差异。在进行蛹后翅解剖时，应去除围膜，不得将其保留在反应孔中。与原方案相比，本方案中的初始固定时间更长，但省略了后续固定步骤。我们发现，蛋白酶K溶液需稀释10倍，以适应脆弱的蛹期翅组织，同时仍能保证探针有效渗透。此外，我们还发现，在抗体染色前对翅组织进行封闭可显著降低背景信号，而将抗体孵育时间延长至4°C下过夜则可增强信号强度。
应用
该实验方案具有多种应用。能够在发育中的蛹翅上定位候选基因的表达，是推断该基因在翅或翅型发育过程中发挥某种功能作用的第一步（Marcus 等，2004；Ramos 等，2006）。如果在其他系统中已知相互作用的多个基...
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致谢
感谢 Jayne Selegue、Margaret Hollingsworth、Jin Berry、Ryo Futahashi、Najmus Sahar Mahfooz、Aleksandar Popadic、Bob Reed 以及 Roche 技术支持团队在本实验方案问题排查过程中提供的帮助。同时感谢 William Piel 对视频编辑提供的建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 固定缓冲液 | 4% 多聚甲醛溶于 PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 溶于 PBS | |||
| 蛋白酶K溶液 | 2.5mg/ml 蛋白酶K溶于PBT | |||
| 消化终止缓冲液 | 2 mg/ml 甘氨酸溶于 PBT | |||
| 预杂交缓冲液 | 配制50 ml PHB：12 ml DEPC处理水 + 25 ml 甲酰胺 + 12.5 ml 20 x SSC + 50 µl Tween 20 + 500 µl 10 mg/ml 鲑鱼精DNA（无RNase，使用前经热变性处理）。 | |||
| 杂交缓冲液 | 在预杂交缓冲液中加入1 mg/ml糖原 | |||
| 封闭缓冲液 | 50 mM Tris（pH 6.8），150 mM NaCl，0.5% IGEPAL（NP40），5 mg/ml BSA | |||
| 抗DIG抗体 | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | 碱性磷酸酶偶联 |
| DIG洗涤与封闭缓冲液试剂盒 | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount水性封片介质 | Sigma-Aldrich | C0612 | 封片介质 |
参考文献
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
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